Raptor通过Wnt3a/β-catenin信号通路促进乳腺癌细胞侵袭与转移的研究

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目的:通过上调或下调乳腺癌细胞系MDA-MB-231(MDA231)和MCF-7细胞中Raptor蛋白的表达,探讨Raptor在乳腺癌细胞中的作用以及在乳腺癌细胞侵袭与转移中的分子机制,进一步研究Raptor能否通过Wnt3 a/β-catenin信号通路促进乳腺癌细胞的侵袭与转移。方法:首先采用蛋白免疫印迹实验(Western blot)检测低转移细胞株MCF-7与高转移细胞株MDA231中Raptor蛋白的表达情况。然后下调Raptor蛋白表达:采用siRNA干扰技术将质粒转染到MDA231中,下调MDA231中Raptor蛋白的表达量后,分为三组:(1)亲本细胞组(MDA231组):常规培养,不作任何处理;(2)对照组(Scr/MDA231组):转染对照干扰质粒;(3)目的组(SiRaptor/MDA231组):转染干扰质粒;上调Raptor蛋白表达:将过表达质粒转染到MCF-7中,上调MCF-7中Raptor蛋白的表达量后,分为三组:(1)亲本细胞组(MCF-7):常规培养,不作任何处理;(2)对照组(MCF-7/Con):转染空载质粒;(3)目的组(MCF-7/Raptor):转染过表达质粒。上述实验组通过MTT实验检测转染后乳腺癌细胞增殖的变化、趋化运动实验检测乳腺癌细胞的运动能力、Transwell侵袭实验检测乳腺癌细胞的侵袭能力、Western blot检测乳腺癌细胞上皮-间质转化标志物的表达情况、核质分离实验检测乳腺癌细胞中β-联蛋白(β-catenin)的转核情况。结果:(1)Western blot检测Raptor在MDA231和MCF-7中的表达,结果显示:Raptor在高转移细胞株MDA231中高表达,而在低转移细胞株MCF-7中低表达。转染后,SiRaptor/MDA231细胞组中Raptor蛋白的表达量较Scr/MDA231细胞组明显下降;MCF-7/Raptor细胞组中Raptor蛋白的表达量较MCF-7/Con细胞组明显升高,表明转染成功。(2)MTT实验结果显示:转染后各组乳腺癌细胞增殖的变化无统计学意义(P>0.05)。(3)通过使用不同浓度的Wnt3a刺激各组乳腺癌细胞,发现随着Wnt3a浓度的升高,乳腺癌细胞趋化运动能力先增强后降低,并且在浓度为100 μg/L时细胞趋化运动能力最强;SiRaptor/MDA231组比Scr/MDA231组细胞趋化运动能力明显降低(P<0.05),MCF-7/Raptor组细胞趋化运动能力比MCF-7/Con组明显增强(P<0.05)。(4)侵袭实验结果显示:SiRaptor/MDA231组中穿过Matrigel小室的细胞数量与Scr/MDA231组相比明显减少(P<0.05);与对照组MCF-7/Con相比,MCF-7/Raptor组中穿过Matrigel小室的细胞数量明显升高(P<0.05)。用Wnt3a刺激处理后,侵袭实验结果显示:SiRaptor/MDA231组与Scr/MDA231组相比细胞侵袭能力明显降低(P<0.05),MCF-7/Raptor组与MCF-7/Con组相比细胞侵袭能力明显增强(P<0.05)。(5)Western blot检测结果显示:SiRaptor/MDA231组与对照组Scr/MDA231相比,波形蛋白(Vimentin)表达量降低而上皮-钙粘蛋白(E-cadherin)表达量升高;与对照组MCF-7/Con相比,MCF-7/Raptor组中Vimentin蛋白表达量升高而E-cadherin蛋白表达量降低。(6)用Wnt3a和抑制剂Dkk1进行不同处理后,Western blot和核质分离实验结果显示:SiRaptor/MDA231组中E-cadherin蛋白表达量明显升高,Vimentin蛋白表达量明显降低,细胞核中β-catenin蛋白表达量降低,而MCF-7/Raptor细胞组中E-cadherin蛋白表达量明显降低,Vimentin蛋白表达量明显升高,β-catenin蛋白表达量升高。结论:1 Raptor在低转移细胞株MCF-7中比高转移细胞株MDA231中表达量低,提示Raptor可能与乳腺癌细胞的侵袭与转移相关。2上调Raptor表达后,乳腺癌细胞的趋化运动能力与侵袭能力增强,Vimentin蛋白表达量升高,E-cadherin蛋白表达量降低;下调Raptor表达后,发现乳腺癌细胞的趋化运动能力与侵袭能力降低,Vimentin蛋白表达量降低,E-cadherin蛋白表达量升高,提示Raptor可能与乳腺癌细胞的侵袭与转移相关。3上调Raptor后,通过Wnt3a处理后乳腺癌细胞的侵袭能力明显增强,Vimentin和β-catenin蛋白表达量明显升高,E-cadherin蛋白表达量明显降低;下调Raptor,通过Wnt3a处理后乳腺癌细胞的趋化运动能力与侵袭能力明显降低,Vimentin和β-catenin蛋白表达量明显降低,E-cadherin蛋白表达量明显升高,提示Raptor可能通过Wnt3a/β-catenin信号通路促进乳腺癌细胞的侵袭与转移。
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