论文部分内容阅读
目的:
胃癌是世界上第二大癌症死因,其发生和发展是一个多基因、多因素、多阶段的复杂过程,涉及多条信号传导通路激活与失活。已有研究显示胃癌与细胞周期调控因子、NF-κB、COX-2/PGE2以及Ras/MAPK、JNK/MAPK、Wnt/β-catenin、TGF-β、BMP、Notch等多条信号通路调节失控密切相关。
而近年来发现,作为Ⅱ类PAK(p21-activatedkinase,PAK)代表性成员-PAK4可与上述多种信号通路发生对话,调节下游各种底物的活性或重要的靶基因的转录水平,在细胞的生长、生存、凋亡、增殖以及侵袭转移中发挥着十分重要的作用,且其过度表达和基因突变广泛存在于多种肿瘤中,其中也包括胃癌。目前PAK4已被确认为潜在的肿瘤治疗新靶点,然而其与胃癌发生发展的机制仍不是很清楚。
此外,最新研究表明,胃癌也与Wnt信号通路密切相关。Wnt/β-catenin信号通路主要调控细胞的分化、增殖,其异常激活或调节蛋白的功能改变可导致各种疾病的发生,尤其与肿瘤的发生紧密相关,并且在30%的胃癌中存在该通路的激活。目前,已有转基因或敲除小鼠模型证明该通路在结直肠癌的发生中起着至关重要的作用,同时HirokoOshima等利用Wnt1转基因小鼠也证明该通路在胃粘膜的单独激活可导致胃癌前病变的发生,而与PGE2炎症通路的同时激活则可导致胃腺肿瘤的发生,这也说明Wnt通路在胃癌中的作用可能是通过与其他信号通路协同发挥的。
而研究显示PAK4与Wnt/β-catenin通路之间存在密切对话,两者之间不但可以相互调控,而且可受某种蛋白或信号通路(如Ras、PI3K/Akt等)的共同调控,甚至还可共同调控下游某些肿瘤相关基因,如CyclinD1、c-myc等的转录,从而可能协同地促进胃癌的发生。因此,本研究通过建立在胃粘膜上皮特异性表达PAK4/Wnt1双转基因小鼠模型,在生物活体内进一步探究PAK4与wnt信号通路之间是否存在对话,并深入研究两者在胃癌病变过程中的作用机制,为以后筛选新型选择性或双靶点抗肿瘤药物提供重要的理论依据和模式生物。
方法:
一、构建在胃粘膜特异性表达转基因载体
以pCMV-3×flag-PAK4(NE)载体为模板,设计引物通过PCR扩增出带有flag标签的PAK4(双位点突变激活型)基因全长,同时引入BamHI单酶切位点,克隆到pMD19-T载体,并测序证实序列的正确性;然后用BamHI分别酶切pBluescript-K19-Wnt1载体(用K19-Wnt1表示)和pMD19-PAK4连接产物,经过去磷酸化处理、回收、连接、转化、鉴定以及测序,从而成功构建了pBlucscript-K19-PAK4(用K19-PAK4表示)表达质粒。
二、在体外鉴定转基因PAK4与Wnt1的表达
将K19-Wnt1和K19-PAK4表达质粒转染胃癌细胞,应用WesternBlot方法检测转基因载体中目的基因在体外细胞水平的表达情况。
三、转基因小鼠的产生
(一)显微注射产生转基因小鼠
将K19-Wnt1和K19-PAK4质粒经PineI单酶切,分别用QIAquidkGelExtractionKit试剂盒纯化4.7Kb和5.3Kb目的片段,应用显微双注射法将外源目的基因导入受精卵原核中,并将注射后的受精卵移植到同期受孕的假孕母鼠输卵管中,预期在新生小鼠中可分别获得K19-Wnt1、K19-PAK4以及K19-Wnt1/K19-PAK4(用K19-PAK4/Wnt1表示)三个转基因小鼠品系。
(二)转基因小鼠的鉴定
提取新生小鼠鼠尾基因组DNA,进行PCR方法鉴定,并应用WesternBlot方法分析PAK4与Wnt信号通路中β-catenin基因在转基因阳性小鼠各组织中的表达情况以及Real-timePCR方法分析PAK4与Wnt1基因在胃组织的转录水平,同时筛选出在胃组织特异性高表达的品系。
结果:
一、构建在胃粘膜特异性表达转基因载体
重组质粒经酶切鉴定、测序分析等均与预期相符,说明成功构建了K19-PAK4转基因载体。
二、在体外鉴定转基因PAK4与Wnt1的表达
与转空载体的对照细胞相比,转染转基因载体的胃癌细胞SGC7901、BCG823中,K19启动子能够特异性启动PAK4和Wnt1的表达。
三、转基因小鼠的产生
(一)显微注射产生转基因小鼠
将K19-Wnt1、K19-PAK4酶切后的目的片段显微双注射301枚供体鼠(BDF1)的受精卵,并用234枚注射过的受精卵移植于8只ICR受体小鼠的输卵管中,经鼠尾基因组DNAPCR鉴定,得到3只FO代K19-PAK4/Wnt1双转基因小鼠,编号为11#、15#、43#;另外再将K19-Wnt1、K19-PAK4酶切后的目的片段分别显微注射277枚、169枚受精卵,并将两者注射成功的260枚、157枚受精卵分别移植于14只、8只ICR受体小鼠的输卵管中,经PCR鉴定,分别得到4只F0代K19-Wnt1、2只F0代PAK4转基因小鼠,编号分别为3#、22#、28#、53#和20#、57#。
(二)转基因小鼠的鉴定
将转基因小鼠F0代与C57BL/6野生型小鼠回交,分别产生各系的F1代小鼠。将F1代阳性小鼠与C57BL/6野生型小鼠回交,共产生77只F2代小鼠,其中雌鼠33只,雄鼠44只,阳性率为44.16%,符合孟德尔遗传定律。通过对F1代双转基因阳性小鼠和同窝野生型小鼠的胃体、胃窦、小肠、肝脏、胰腺、肺脏、肾脏、心脏以及脑组织进行WesternBlot检测,发现与野生型小鼠相比,双转基因小鼠中PAK4在胃组织的表达和活性明显增高,而β-catcnin的活性也显著增高;同时,Real-timePCR方法分析得到转基因阳性鼠胃组织中PAK4和Wntl基因的mRNA水平较正常鼠也明显增高。此外,通过WesternBlot检测筛选出双转基因小鼠中两个高表达品系(F0-11#和F0-43#)。
结论:
1、K19启动子在体外胃癌细胞中能够特异性启动目的基因的表达。
2、成功构建了在胃粘膜特异性表达的PAK4/Wnt1、PAK4、Wnt1三种转基因小鼠模型。