血管损伤是缺血性心脑血管疾病发展过程中的最早期病变,是威胁人类健康的重要危险因素。病理条件下,氧化应激、炎症反应及脂质代谢紊乱,内皮源性舒张因子如NO合成减少,生物活性降低,导致血管舒张功能障碍;同时,内皮细胞表面粘附分子增加,血小板聚集,细胞间隙增大,屏障功能破坏,紧密连接开放,脂质沉积,引起血管结构损伤;血管功能障碍及结构损伤共同推动动脉粥样硬化的形成,引发心脑血管疾病。对血管损伤的早期预防、诊断及治疗,已成为遏制心脑血管疾病发展的前瞻性战略方针。三七总皂苷（Panaxnotoginseng saponins,PNS）是传统中药三七活血化瘀的主要有效成分,临床用于防治脑卒中、冠心病、心绞痛、高血压等心脑血管疾病。以往研究主要集中在三七总皂苷注射制剂对缺血致心脑血管急性损伤的保护,对血管损伤的保护作用评价也多停留在表观指标的检测。本课题从防治血管损伤的角度出发,在评价PNS口服给药超早期治疗对缺血致心脑血管损伤保护作用的基础上,探索PNS对缺血致血管内皮细胞间紧密连接损伤、对SHRSP.ZF大鼠血管舒张功能障碍的改善作用及内在机制,为其临床治疗学提供理论依据。第一部分 三七总皂苷对缺血致心脑血管损伤的改善作用前期临床及实验研究显示,PNS对心脑血管损伤有明确保护作用,然而以往研究对PNS保护缺血致急性期心脑血管损伤的研究多以腹腔注射/静脉注射为给药方式,且研究方法大多局限于传统分子生物学手段,略乏直观性、新颖性。本实验借助现代微循环荧光显微镜动态可视化观察系统,采用急性心肌缺血模型、急性脑缺血模型、急性脑缺血再灌注模型,评价了 PNS 口服给药早期治疗对缺血致心脑血管损伤的保护作用,并考察了 PNS对缺血再灌注后脑微血管白细胞粘附及白蛋白渗出的改善作用;借助激光多普勒血流仪,考察了 PNS对缺血致脑血流量降低的改善作用。目的:采用冠脉结扎致急性心肌缺血模型、MCAO脑缺血再灌注模型及单侧颈总动脉结扎致脑缺血模型,研究PNS 口服给药早期治疗对缺血致急性心脑血管损伤的保护作用,并考察其改善缺血致脑微循环障碍、增加脑血流量的作用。方法:急性心肌缺血模型:Wistar大鼠随机分为6组,即正常组、模型组、血府逐瘀480mg/kg组,PNS 60、30、15 mg/kg组,术前预防灌胃给药3d,左冠状动脉前降支结扎造成心肌缺血,术后4h继续给药,每12h给药1次,检测术后24h心肌梗死范围、心电图及心肌酶。急性脑缺血再灌注模型:ICR小鼠随机分为正常组、模型组、银杏叶片238.5 mg/kg组,PNS 90、45、22.5 mg/kg组。术前预防灌胃给药3d,2次/d,线栓法致大脑中动脉栓塞脑缺血模型,缺血1.5h后进行再灌注手术,术后4h继续给药,每12h给药1次,检测术后72h脑梗死范围、神经功能评分、病理结构;采用微循环荧光显微观察系统,检测术后72h白细胞黏附、白蛋白渗出。急性脑缺血模型:ICR小鼠随机分为6组,即正常组、模型组、银杏叶片180 mg/kg组、PNS 90、45、22.5mg/kg组,术前灌胃给药3d,右侧颈总动脉结扎复制脑血流量降低模型,用激光多普勒血流仪记录单侧颈总动脉结扎前5min及术后30min脑组织血流变化。结果:1.结扎左冠状动脉前降支后,模型组大鼠心肌梗死范围、心电图异常阳性率显著升高,血清 LDH、CK、CK-MB、α-HBDH 及 AST 含量明显升高（P<0.01）。PNS 60、30、15 mg/kg可显著降低心肌缺血模型大鼠的心肌梗死范围;PNS 60 mg/kg组显著抑制心电图异常阳性率升高;PNS 60、30、15 mg/kg组显著降低血清LDH、CK及CK-MB含量（P<0.05,0.01）。2.MCAO致脑缺血再灌注72 h后,模型组小鼠出现明显脑梗死,HE染色显示患侧大脑皮层细胞失去层次排列,神经细胞水肿、变性、萎缩,半暗带部位空泡化;神经细胞丢失明显,细胞数量明显减少;血管管腔扩大并充血。PNS 90、45mg/kg可显著降低脑梗死范围,减轻半暗带部位细胞变性和丢失,可见明显的胶质细胞增生,血管管腔扩大偶见充血。3.MCAO致脑缺血再灌注72 h后,模型组小鼠患侧脑皮层微血管白细胞黏附数、白蛋白渗出率显著增加（P<0.01）。PNS 90、45 mg/kg显著降低白细胞黏附数量;PNS 45 mg/kg组显著降低白蛋白渗出率（P<0.05,0.01）。4.颈总动脉结扎致单侧脑缺血后,模型组小鼠患侧脑皮层血流量明显下降（P<0.01）。PNS 90、45、22.5 mg/kg组在结扎后10、20、30min内,模型小鼠患侧脑皮层血流明显增加（P<0.05,0.01）。结论:PNS 口服早期治疗对缺血致急性心脑血管损伤有保护作用,与降低微循环白细胞粘附、抑制白蛋白渗出、增加组织血流量有关。第二部分 三七总皂苷对SHRSP.ZF大鼠血管舒张功能障碍的改善作用血管舒张功能是诱导“内皮-血压-心血管疾病”链的载体及始动因子。病理条件下,内皮源性NO合成减少,血管舒张功能发生障碍,血压异常,加速心脑血管疾病的发展。上述研究通过单侧颈总动脉结扎致脑缺血小鼠模型,观察到PNS能够显著促进缺血后患侧脑皮层血流量的增加,提示PNS对血管舒缩功能障碍的改善可能是其恢复组织血液循环从而保护心脑血管损伤的作用环节之一。SHRSP.ZF大鼠模型自幼龄时期呈现典型的代谢综合征特性,其胸主动脉及肠系膜动脉存在明显的舒张功能障碍。本实验基于NO信号通路,借助SHRSP.ZF大鼠胸主动脉及肠系膜动脉,考察PNS及其单体Rg1、Rb1、Rd对血管舒张功能障碍的改善作用。目的:采用SHRSP.ZF模型大鼠,借助离体血管环手段,从体内外两个角度,研究PNS及其单体成分Rg1、Rb1、Rd对ACh、SNP介导的SHRSP.ZF大鼠胸主动脉及肠系膜动脉血管舒张功能障碍的改善作用。方法:离体实验:采用18-20周龄SHRSP.ZF大鼠,分离胸主动脉、肠系膜动脉血管环,胸主动脉血管环分为模型组,PNS 10、30、90 mg/L组、Rb1 30.42 mg/L组、Rg1 27.99 mg/L组、Rd 6.3 mg/L组;肠系膜动脉血管环分为模型组、PNS 90 mg/L组。采用ACh考察内皮依赖性血管舒张功能,检测内皮细胞完整性;预孵育血管30 min后,观察药物对Pheny1预收缩血管ACh、SNP介导的血管舒张功能的影响。体内试验:采用7周龄SHRSP.ZF模型大鼠,分为模型组、PNS 30 mg/kg组,灌胃给药13 w,从给药后第4 w开始检测血压,于13 w检测血清中总胆固醇、甘油三酯、胰岛素、血糖、TBARS及SOD水平;离体血管环手段检测ACh、SNP介导的胸主动脉及肠系膜动脉的血管舒张功能;WB检测胸主动脉eNOS/sGC的蛋白表达。结果:离体实验结果显示,与正常组相比,模型大鼠ACh、SNP诱导的肠系膜动脉及胸主动脉血管舒张功能显著降低（P<0.01）。PNS 30、90mg/L组可以显著促进SNP介导的模型大鼠胸主动脉血管舒张,PNS 90mg/L组可以显著促进模型大鼠SNP介导的肠系膜动脉血管舒张（P<0.05）,对ACh介导的模型大鼠胸主动脉及肠系膜动脉血管舒张没有显著影响。Rb1 30.42 mg/L组可显著促进SNP介导的模型大鼠胸主动脉血管舒张,Rg1 27.99 mg/L组、Rd 6.3 mg/L组对SNP介导的血管舒张没有影响。在L-NAME干预下,PNS显著促进SNP诱导胸主动脉血管舒张（P<0.05）;在ODQ干预下,PNS介导SNP血管舒张被完全抑制。体内实验结果显示,PNS 30 mg/kg灌胃给药13w后,显著降低SHRSP.ZF模型大鼠血压（P<0.05）,对血清总胆固醇、甘油三酯、胰岛素、血糖、TBARS及SOD水平无明显影响;可显著促进SNP介导的肠系膜动脉血管舒张,对SNP介导胸主动脉血管舒张有升高趋势,显著上调胸主动脉sGC蛋白表达（P<0.05）;显著上调ACh介导胸主动脉血管舒张（P<0.05）,对胸主动脉eNOS蛋白表达没有影响。结论:离体实验结果显示,PNS对SNP介导非内皮依赖性的SHRSP.ZF模型大鼠血管舒张有促进作用,人参皂苷Rb1是其改善SNP介导血管舒张功能障碍的有效单体成分之一。体内实验结果显示,PNS长期给药可显著降低SHRSP.ZF模型大鼠血压,改善SNP介导非内皮依赖性血管舒张功能障碍,与上调NO下游靶点sGC水平有关。此外,PNS长期给药可显著改善ACh介导内皮依赖性的血管舒张功能障碍,但对内皮细胞eNOS的蛋白表达没有影响。第三部分 三七总皂苷对缺血致血管内皮细胞间紧密连接损伤的改善作用上述研究基于PNS对缺血致心脑血管损伤的保护作用,进一步明确了改善血管舒张功能障碍的作用机制,与激活NO信号通路有关。然而,NO不仅仅通过下游sGC/cGMP调控血管舒张功能障碍,其上游靶点VEGF/VEGFR2/PI3K/Akt的激活还通过介导内皮细胞凋亡、内皮细胞存活、血管新生等环节参与调控血管结构损伤。在脑缺血再灌注损伤条件下,脑微血管屏障功能严重破坏,内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5及Occludin显著下降,使得大分子物质渗透进入脑组织,引发脑水肿;同时,脑损伤后的水肿、小胶质细胞活化、星形胶质细胞增生和神经炎症,进一步推动脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白的深度降解,致使脑血管实质性病变。前期研究结果显示,PNS对缺血致脑血管白蛋白渗出有显著抑制作用,提示对脑微血管紧密连接的调控可能是其改善心脑血管疾病损伤的另一作用环节。本实验将基于VEGF、MMPs信号通路,考察PNS对缺血致血管内皮细胞间紧密连接损伤的保护作用,为其治疗血管性疾病提供新的理论依据。目的:采用氧糖剥夺致HUVEC细胞损伤模型,考察PNS及其单体Rg1、Rb1对氧糖剥夺致血管内皮紧密连接损伤的保护作用;采用脑缺血再灌注小鼠模型,考察PNS对缺血致血管内皮细胞紧密连接损伤的保护作用及其治疗机制。方法:体外实验:HUVEC接种于Transwell细胞小室,待细胞融合后,设立实验组别:正常组、模型组、PNS 10、20、40mg/L 组以及 Rb1 13.52 mg/L、Rg1 12.44 mg/L 组,于缺氧同时进行药物干预,缺氧6h复氧24h后,检测HUVEC内皮细胞电阻值以及内皮渗透性的变化;采用激光共聚焦显微镜,免疫荧光法检测HUVEC细胞ZO-1、Claudin-5蛋白表达的变化。体内试验:ICR小鼠随机分为正常组、模型组、银杏叶片238.5 mg/kg组、PNS 90、45、22.5 mg/kg组。术前预防灌胃给药3d,2次/d,线栓法致大脑中动脉栓塞脑缺血模型,缺血1.5h后进行再灌注手术,术后4h继续给药,每12h给药1次,检测术后72h患侧脑皮层紧密连接蛋白ZO-1/Claudin-5/Occludin蛋白表达;检测PNS 45 mg/kg灌胃给药后,脑缺血再灌注小鼠患侧脑皮层紧密连接相关MMP-9、MMP-12以及VEGF、VEGFR2、p85-PI3K、p110-PI3K、p-Akt（Ser473）、p-Akt（Thr 308）、Akt的蛋白表达变化。结果:1.体外实验结果显示,与正常对照组相比,HUVEC细胞缺氧6h复氧24h后内皮细胞间紧密连接电阻显著降低,细胞渗透性显著升高（P<0.05）。PNS 20、40mg/L组能够显著抑制模型组紧密连接电阻的降低,抑制HUVEC细胞渗透性的升高（P<0.01,P<0.05）。人参皂苷Rb1能够显著升高OGD6h复氧24h后内皮紧密连接电阻,降低HUVEC细胞渗透性（P<0.05）。免疫荧光检测结果显示,正常组HUVEC细胞的ZO-1及Claudin-5蛋白主要分布于细胞膜周围,排列连续,显示出内皮细胞的典型铺路石排列。缺氧6h复氧24h损伤后,模型组细胞边缘的紧密连接蛋白显著减少,环形结构断裂,甚至消失,细胞核内紧密连接蛋白呈增加趋势。PNS 20、40 mg/L及Rb1 13.52 mg/L可观察到细胞间紧密连接局部恢复,呈铺路石样结构。2.体内实验结果显示,透射电镜超微结构检测结果:正常组血管内皮细胞重叠,紧密连接基本完好,内膜完整,内皮细胞微绒毛减少,胞饮小泡无明显增加;内膜下可见清晰半透明基底膜;细胞内部细胞器未见明显异常。缺血再灌注72h后,模型组内皮细胞严重受损,血管周围肿胀严重,内皮细胞间紧密连接开放,微绒毛增多,胞饮小泡转运增加,细胞间连接增宽,或是模糊、消失;基底膜肿胀、增厚,基底膜内空泡形成;细胞器稀疏。PNS 45 mg/kg干预后,血管周围水肿减轻,组织结构紧密排列,胶质细胞突起稍肿胀;内皮细胞紧密连接尚完整,未完全开放,基膜轻度增宽,基膜结构完整边界清晰,基膜内空泡减轻;基膜外胶质膜肿胀减轻,细胞器结构正常。WB检测结果显示,PNS 45 mg/kg可以显著增加脑缺血再灌注模型大鼠脑皮层ZO-1、Claudin-5、Occludin的蛋白表达（P<0.05）;PNS 22.5 mg/kg可以显著增加模型大鼠ZO-1、Claudin-5的表达（P<0.05）。PNS 45 mg/kg可以显著抑制模型大鼠脑皮层MMP-9的表达（P<0.05）,升高 VEGF、VEGFR2、p85-PI3K、p-Akt（Ser 473）的蛋白表达水平（P<0.05）,对P110-PI3K、p-Akt（Thr 308）、Src的蛋白表达没有影响。结论:PNS对缺血致血管内皮细胞间紧密连接损伤有保护作用,与MMP-9及VEGF/VEGFR2/PI3K/Akt信号通路相关;人参皂苷Rb1是其改善血管内皮紧密连接损伤的有效单体成分之一。