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背景感染仍然是创伤病人最常见的并发症,引起创伤感染的病原体以细菌为主。多数学者在创伤感染的菌群调查中发现,革兰氏阴性杆菌感染率高于革兰氏阳性球菌的感染率,并常有多种细菌的混合感染,且耐药菌株逐年增加。早期快速诊断创伤感染细菌并合理应用抗生素治疗对于创伤感染的诊治至关重要。传统的微生物培养鉴定法是诊断细菌感染最可靠的方法,但是耗时长、操作繁琐。因此,迫切需要建立一种快速、简易的创伤感染细菌诊断方法。分子生物学技术的不断发展使快速检测病原微生物成为可能,其中,细菌基因诊断成为研究的热点。目前,作为细菌的“活化石”,16S rDNA是常被选用细菌分类和鉴定的基因,但对于某些细菌而言种间差异较小,分辨力有限。16S-23S rDNA间区的长度和碱基序列相比于16S rDNA具有更强的特异性,可依此对不同种的菌群进行“指纹”识别。但是,在某一临床样本中同时检测多种细菌仍然是分子生物学技术面临的难题之一。压电DNA传感器将压电生物传感器灵敏度高与DNA杂交反应特异性强的优势结合在一起,并可以实现多阵列平行分析,因此,在快速、准确以及同时检测多种临床病原微生物方面具有广泛的应用前景。目前,我们已经建立了压电DNA传感器检测平台,实现了对人乳头瘤病毒、乙肝病毒、表皮葡萄球菌以及人巨细胞病毒等病原微生物的快速诊断。虽然如此,在这些研究中,压电DNA传感器还局限于对单个细菌或病毒进行检测。本研究构建了一种便携式2×5型压电DNA传感器阵列,实现了快速、准确和同时检测5种创伤感染细菌。我们筛选了3种较难培养的病原菌,即产气荚膜梭菌、破伤风梭菌和肺炎链球菌,以及2种引起创伤感染最常见的病原菌,即铜绿假单胞菌与大肠埃希菌,作为研究对象。针对创伤感染细菌16S-23S rDNA间区自行设计PCR扩增通用引物,应用该传感器阵列检测PCR产物。检测过程中引入了纳米金颗粒质量信号放大系统,进一步提高了检测的灵敏度。此外,以50例临床样本为检测对象,以常规细菌培养法为参照方法,对建立的压电DNA传感器阵列检测法进行方法学比较和评价。方法1、利用Primer Premier 5.0软件,以细菌16S-23S rDNA间区为靶序列,在16S rDNA 3’端与23S rDNA 5’端保守区自行设计通用引物,筛选5种常见创伤感染细菌,提取其基因组DNA并进行PCR扩增,对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳和测序。测序前先采用凝胶纯化的方法分离片段最小的条带,通常也是优势条带,然后送上海英骏公司测序。2、将巯基化的单链DNA探针固定于压电DNA传感器石英晶振金膜表面,封闭后加入合成的生物素化的互补靶DNA与之进行杂交反应,最后用5 nm粒径的链亲和素标记的胶体金追加标记于杂交后的生物素化的靶DNA上,以增加石英晶振金膜表面的质量负载,从而降低石英晶振的响应频率,进一步放大频移信号。优化纳米金颗粒溶液的使用浓度并分析该传感器对合成靶序列的最低检出限。3、各待测细菌DNA探针与16S-23S rDNA间区片段最小的拷贝序列互补,并遵循探针设计的一般原则择优选取。标准菌株PCR产物纯化后变性解成单链,与固定探针并封闭后的压电DNA传感器阵列进行杂交反应,引入上述纳米金颗粒信号放大系统,验证各探针对靶细菌检测的特异性,以铜绿假单胞为例分析该传感器对菌悬液的最低检出限。4、以50例临床样本为检测对象,包括31例脓液和19例伤口分泌物,以常规细菌培养法为参照方法,对建立的压电DNA传感器阵列检测法进行方法学比较和评价。结果1、5种细菌基因组DNA PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱与预期一致,且与人类基因组DNA、白假丝酵母菌、HBV DNA无交叉反应。PCR产物经测序比对后发现同源性均在99.5%以上,由此可以证实该通用引物及PCR反应体系对待测细菌PCR扩增的有效性和准确性。2、当纳米金颗粒溶液终浓度为9%(体积比)时,频移信号最大。我们将阳性结果的阈值设为本底(空白对照)频移平均值加3倍标准差,即X + 3SD,为24.5 Hz,得到最低检出限为10?12 M。另外,对不同终浓度的阳性靶序列检测后发现,阳性靶序列终浓度从10?12至10?8 M时,频移与其终浓度的lg值之间具有显著的线性关系,线性回归方程为:y = 20.94lgx + 285.88,相关系数为0.958,P < 0.01。3、各探针检测阴性细菌所引起的非特异性信号与检测阳性细菌所引起的特异性信号具有显著性差异(P < 0.05),说明该传感器交叉反应弱,特异性强。以铜绿假单胞菌为例,最低检出限为1.5×102 CFU/ml。另外,对不同浓度的铜绿假单胞菌悬液检测后发现,菌悬液浓度从1.5×102至1.5×108 CFU/ml时,频移与其浓度的lg值之间具有显著的线性关系,线性回归方程为:y = 12.921lgx ? 2.597,相关系数为0.975,P < 0.01。4、参考方法检测5种待测细菌17例阳性样本中,QCM法检测有1例为阴性,其余16例与之一致;而参考方法检测5种细菌33例阴性样本中,QCM法检测有3例为阳性,其余30例与之一致。我们选用McNemar检验对数据处理后发现两种方法没有显著性差异(p > 0.05)。与作为“金标准”的细菌培养法比较,QCM法检测的灵敏度为94.12 %,特异度为90.91 %。结论1、自行设计的通用引物可以实现对多种创伤感染细菌16S-23S rDNA间区进行PCR扩增,为细菌基因诊断提供了特异性强于16S rDNA的分子靶点。2、我们成功构建了2×5型压电DNA传感器阵列,实现了快速、准确和同时检测5种创伤感染细菌,该方法便于携带、操作简单、灵敏度高、特异性强、可靠性好而且诊断快速,特别是对于厌氧菌而言具有一定的优势。3、检测过程中引入纳米金颗粒质量信号放大系统,进一步提高了压电DNA传感器检测的灵敏度。4、该方法与细菌培养法呈现良好的一致性,为压电生物传感器病原菌检测系统进一步应用于临床诊断甚至野战、自然灾害等特殊环境奠定了实验基础。