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目的能量代谢与肥胖相关疾病严重威胁人类健康,能量摄入过多是肥胖主要原因之一。中枢神经系统除直接参与调控外周消化系统外,还可通过摄食“奖赏”通路进一步影响摄食行为,从而调控能量代谢。伏隔核(Nucleus accumbens,NAc)是中枢奖赏通路中极为重要的一环,可涉及调控刺激动机、学习及奖励行为等多种复杂生理行为。研究发现,NAc内有大量γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)神经元,这些神经元可参与调节体内能量平衡,尤其是对摄食行为的调控。此外,近期研究发现,丘脑未定带(Zona incerta,ZI)与摄食行为关系密切,是参与摄食和胃功能调节的又一重要核团。光遗传学技术研究显示,光刺激ZI内GABA神经元可导致小鼠暴饮暴食或强迫进食行为。胰高血糖素样肽1(Glucagon like peptide 1,GLP-1)可明显抑制胃排空、减少肠道蠕动,进而抑制摄食,其也是目前治疗肥胖的重要靶点之一。有研究报道,在中枢,GLP-1神经元投射广泛,其纤维可投射至整个大脑,包括NAc。因此,本研究拟采用逆行追踪结合荧光免疫组化染色、单细胞外放电记录、核团微量注射药物、在体胃运动记录等研究方法,观察未定带-伏隔核(ZI-NAc)间GABA神经通路,研究ZI-NAc GABA神经通路对大鼠胃功能和摄食的影响及潜在机制,目的是探讨ZI-NAc间是否有GABA能神经通路,该通路是否参与大鼠胃功能和摄食的调控及其潜在机制。方法1.选用10～12周龄雄性Sprague Dawley(SD)大鼠。2.随机选取5只大鼠,采用逆行追踪结合荧光免疫组化技术,观察ZI-NAc之间GABA神经通路构成;3.采用单细胞外放电记录,观察NAc微量注射GABA或其受体拮抗剂Bicuculline(Bic)等对大鼠胃牵张(GD)反应性GLP-1敏感性神经元放电活动的影响;观察电刺激ZI、或预先NAc注射GABA-A受体(GABA-AR)拮抗剂Bic再电刺激ZI,观察GD反应性GLP-1敏感性神经元的放电活动的改变;4.参照大鼠脑图谱于大鼠NAc置管,采用在体胃运动记录、胃酸分泌测定以及摄食分析等实验方法,观察NAc微量注射GABA或Bic对大鼠胃运动频率和幅度、胃酸分泌量、以及0-2 h累计摄食量的影响。实验设计及分组:随机选取48只NAc置管大鼠,并按照随机数字法分为8组(n=6):(1)0.5μL生理盐水组(NS组);(2)0.5μg GABA组;(3)2.5μg GABA组;(4)5μg GABA组;(5)10μg Bic组;(6)10μg GLP-1受体(GLP-1R)拮抗剂Exendin9-39组(10μg Ex9组);(7)10μg Bic+2.5μg GABA组;(8)10μg Ex9+2.5μg GABA组。上述各组NAc微量注射0.5μL药物或NS,观察大鼠胃运动、胃酸分泌以及0-2h摄食量改变;另外,随机选取10只大鼠,随机分为2组(n=5),在观察NAc内微量注射GABA对GD反应性GLP-1敏感性神经元放电活动变化的同时,观察大鼠在体胃运动变化,以NAc内注射NS为对照组。5.参照大鼠脑图谱于大鼠NAc及ZI置管,采用电刺激ZI,或预先NAc注射Bic再电刺激ZI方法,观察大鼠胃运动频率和幅度、胃酸分泌量、以及0-2 h累计摄食量的改变。实验设计及分组:选取36只大鼠随机分为6组(n=6):(1)假电刺激(SS)组;(2)电刺激ZI(ES)组;(3)假电刺激+NAc内微量注射0.5μL NS(SS+NS)组;(4)电刺激ZI+NAc内微量注射0.5μL NS(ES+NS)组;(5)假电刺激+NAc内微量注射0.5μL 10μg GABA-AR拮抗剂Bic组(SS+Bic)组;(6)电刺激ZI+NAc内微量注射0.5μL 10μg GABA-AR拮抗剂Bic组(ES+Bic)组。结果1.荧光金(FG)逆行示踪结合荧光免疫组化研究显示,NAc微量注射0.2μL 3%荧光金,7天后荧光显微镜下可见ZI内有FG标记的神经元,在同一切片上进行GABA免疫荧光组化染色,镜下ZI内有GABA免疫阳性神经元表达,其中部分GABA免疫阳性神经元与FG共存。提示,ZI内部分GABA免疫阳性神经元可发出神经纤维投射至NAc,即在ZI-NAc间可能有GABA神经通路。2.NAc微量注射GABA对GLP-1/GD-R神经元放电活动的影响研究显示,NAc内有GD神经元;NAc微量注射GABA,大部分GLP-1/GD-E或GLP-1/GD-I神经元的放电活动显著减弱(P<0.05),而预先NAc注射GLP-1R拮抗剂Ex9,可明显降低GABA对GLP-1/GD-R神经元的放电活动的抑制作用(P<0.05)。提示,NAc内有接收胃牵张刺激传入信息神经元(GD神经元),大部分GD神经元对GLP-1有应答(GLP-1/GD-R神经元),GABA参与GLP-1/GD-R神经元兴奋性调控,GLP-1受体信号通路参与GABA该过程调控。3.电刺激ZI对NAc GLP-1/GD-R神经元放电活动的影响研究显示,电刺激ZI可兴奋NAc内大多数GLP-1/GD-E和GLP-1/GD-I神经元(P<0.05),预先NAc注射GABA-AR拮抗剂Bic,可明显抑制电刺激ZI对这些GLP-1/GD-R神经元的兴奋效应(P<0.05)。提示,在ZI-NAc之间可能有直接或间接GABA功能通路,该通路可能参与胃传入信息调控。4.NAc微量注射GABA对大鼠在体胃运动的影响研究显示,与NS组比较,NAc微量注射GABA,约3 min后大鼠胃运动幅度(P<0.05～0.01)和运动频率(P<0.05～0.01)均显著增加,且呈显著剂量依赖关系。GABA促胃运动幅度和频率的效应可持续约10 min。若NAc注射Bic或Ex9,可阻断或明显减弱GABA对大鼠胃收缩幅度(P<0.05)和收缩频率(P<0.05)促进效应。但NAc单独注射Bic或Ex9,大鼠胃运动幅度(P>0.05)或频率(P>0.05)均无显著改变。提示,NAc外源性GABA可促进大鼠胃动力,该效应可能通过激活GABA受体信号通路而实现的,GLP-1受体信号通路可能也参与了该过程调控。5.NAc微量注射GABA对实时胃运动和GLP-1/GD-R神经元放电活动的影响研究显示,NAc微量注射GABA,GLP-1/GD-E神经元(P<0.05)或GLP-1/GD-I神经元(P<0.05)放电频率均显著降低;同时发现,在大约4 min后,大鼠胃运动幅度(P<0.05)和胃运动频率(P<0.05)也显著增加,且峰值持续大约10 min。提示,NAc部分GLP-1/GD-R神经元可能参与GABA诱导的胃运动增强效应调控。6.NAc微量注射GABA对大鼠胃酸分泌的影响研究显示,与NS组比较,NAc微量注射GABA,可显著增加大鼠胃酸分泌量(P<0.05～0.01),且呈显著剂量依赖性关系;与GABA组相比,NAc注射GABA+Bic混合液或注射GABA+Ex9混合液,可阻断(P<0.01)或降低(P<0.05)GABA促大鼠胃酸分泌作用。但NAc单独注射Bic或Ex9,大鼠胃酸分泌量无显著改变(P>0.05)。提示,NAc外源性GABA可显著促进大鼠胃酸分泌,该作用可能与GABA受体信号通路激活有关,GLP-1受体信号通路可能也参与了该过程调控。7.NAc微量注射GABA对大鼠0-2小时摄食量的影响研究显示,与NS组比较,NAc微量注射GABA,大鼠0-2 h摄食量显著增加(P<0.05)。与GABA组相比,NAc注射GABA+Bic混合液或GABA+Ex9混合液,大鼠0-2 h摄食量明显减少(P<0.05)。但NAc单独注射Bic或Ex9,大鼠0-2 h摄食量无显著改变(P>0.05)。提示,NAc外源性GABA可显著促进大鼠急性阶段摄食,GABA和GLP-1受体信号通路的激活与GABA促大鼠摄食效应密切相关。8.NAc注射Bic对电刺激ZI诱导大鼠在体胃运动的影响研究显示,与假电刺激组(SS)比较,电刺激ZI,大鼠胃运动幅度(P<0.05)和运动频率(P<0.05)均显著增加,且这种促进效应可持续约10 min。但NAc预先注射Bic,再电刺激ZI(Bic+ES)可明显抑制大鼠胃收缩幅度(P<0.05)和收缩频率(P<0.05)。单独NAc注射Bic对大鼠胃运动无显著影响(P>0.05)。提示,ZI-NAc间可能有参与胃运动调控的GABA能神经通路。9.NAc注射Bic对电刺激ZI诱导大鼠胃酸分泌的影响研究显示,与SS组比较,电刺激ZI可明显促进大鼠胃酸分泌量(P<0.01)。但NAc预先注射Bic,大鼠胃酸分泌量明显减少(P<0.05)。单独NAc注射Bic对大鼠胃酸分泌量无显著影响(P>0.05)。提示,ZI-NAc间GABA能神经通路可能参与胃酸分泌调控。10.NAc注射Bic对电刺激ZI诱导大鼠摄食的影响研究显示,与SS组比较,电刺激ZI可明显促进大鼠0-2 h摄食量(P<0.05)。但NAc预先注射Bic,电刺激ZI诱导的促大鼠0-2 h摄食量明显减少(P<0.05)。单独NAc注射Bic对大鼠0-2 h摄食量无显著影响(P>0.05)。提示,电刺激大鼠ZI可促进大鼠摄食,可能与NAc内GABA增加有关;还提示,ZI-NAc间GABA能神经通路可能还参与大鼠急性阶段摄食调控。结论NAc内有接收胃机械牵张刺激传入信息的GD神经元,该神经元兴奋改变可能与胃动力变化相关;在ZI-NAc间存在GABA神经和功能通路,该通路可参与胃动力、胃酸分泌和摄食调控,GABA-A受体激活是实现该调控的重要因素,GLP-1受体信号通路也参与了该过程调控。