论文部分内容阅读
目的:设计合成二苯乙烯基嘧啶类新型表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)抑制剂,通过初步评价其对非小细胞肺癌(non-small-cell carcinoma,NSCLC)的抑制活性及毒性,以期筛选出活性更好、毒性更低、抗耐药性更加优良的化合物。方法:以第三代EGFR抑制剂Rociletinib为先导物,基于分子杂合策略,设计、合成一系列新型二苯乙烯基嘧啶衍生物;借助1H NMR、13C NMR、HRMS、MS对新化合物进行分子结构鉴定;采用体外荧光激酶检测方法,测定所得到新化合物分别对野生型EGFR(wild-type EGFR,EGFRWT)和EGFRT790M/L858R(EGFR 790位Thr→Met,EGFR 858位Leu→Arg)激酶的抑制作用活性;以MTT比色法测定不同浓度新化合物作用于选定细胞株72小时以后对于细胞存活率的影响;采用DAPI染色及MTT法测定优选化合物与上市药物Gefitinib在相同条件下抗肿瘤活性;以流式细胞术来考察优选化合物对肺癌细胞H1975凋亡的影响;利用薄膜分散法将优选化合物SAR-007制备成药物脂质体;利用MTT法检测由化合物SAR-007制备的药物脂质体、空白脂质体及化合物SAR-007对非小细胞肺癌细胞H1975存活率影响。结果:合成纯化获得12个新型二苯乙烯基嘧啶类EGFR抑制剂,通过核磁共振及高分辨质谱技术确定目标化合物结构正确;激酶试验中新化合物普遍对EGFRT790M/L858R显示出良好的抑制作用,IC50值(half maximal inhibitory concentration,半抑制浓度)在6.8-29.4 nMol/L范围内,较参照药Gefitinib(IC50:1202 nMol/L)活性提高40-176倍;化合物SAR-007对EGFRT790M/L858R激酶(IC50:11.0 nMol/L)表现出强的抑制作用,和较高的选择性(SI=49,SI=EGFRWT:EGFRT790M/L858R);MTT实验结果显示,绝大部分新化合物对A431鳞癌细胞和A549肺腺癌细胞有强的抗增殖活性,较Gefitinib提高2-35倍,对肺上皮正常细胞HBE的毒性性较上市药物有所降低。尤其是化合物SAR-006(IC50:2.318μMol/L)和SAR-007(1C50:2.91μMol/L)对耐药型H1975肺癌细胞也表现出较为良好的抑制活性,且对HBE细胞的半抑制浓度大于20μMol/L,远大于其有效抑制H1975细胞增殖的浓度;DAPI荧光染色结果直观显示,化合物SAR-007在相同条件下对于H1975肺癌细胞的抑制活性较上市药物效果更为显著;药物浓度-存活率曲线实验结果表明,SAR-007对于H1975的杀伤作用强于Gefitinib;细胞凋亡试验结果表明备选化合物SAR-007对H1975细胞的抑制作用以浓度依赖性方式明显增加,凋亡率范围为40.4-79.8%;通过薄膜分散法制备的SAR-007脂质体粒径分布均匀(Z-Average:197.7nm,PdI:0.354),外观良好,通过MTT法所测得结果显示药物制备成脂质体后对于H1975细胞的抑制活性有小幅度提高。结论:本研究得到12个新型二苯乙烯基嘧啶类EGFR抑制剂,该系列化合物具有良好的抑制野生型的EGFR和突变型EGFRT790M活性;发现化合物SAR-007对突变型EGFRT790M表现更加优良的抑制活性、选择性和细胞毒性;化合物SAR-007通过作用于EGFRT790M激酶,进而有效抑制肺癌细胞产生的耐药性;SAR-007脂质体实验为此类分子的活性改善提供了借鉴;本论文的结果为二苯乙烯基嘧啶类新型靶向EGFR抑制剂的深入开发提供了依据。