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第一部分CARLo-5在食管癌组织和细胞中的表达及对其生物学特性的影响目的:研究癌症相关区域长链非编码RNA CARLo-5在食管癌组织和细胞中的表达及对食管癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡和周期的影响。方法:1应用Realtime-PCR法检测食管癌组织、癌旁组织以及食管癌细胞中Lnc RNA CARLo-5的表达。2应用MTS法、Transwell迁移、Matrigel侵袭和划痕愈合实验检测敲低/过表达CARLo-5基因对食管癌细胞增殖活性、侵袭和迁移能力的影响。3应用流式细胞术检测CARLo-5对KYSE30和KYSE180细胞周期和早期凋亡的影响。4应用MTS和流式细胞术检测CARLo-5在KYSE30和KYSE180细胞中对5氟尿嘧啶药物敏感性的影响。结果:1 Realtime-PCR实验结果显示,与癌旁组织相比,食管癌组织中CARLo-5表达水平显著上调(P<0.05);与正常食管上皮细胞相比,多种食管癌细胞中CARLo-5表达水平上调(P<0.05)。2 MTS检测结果显示,敲低CARLo-5基因可抑制KYSE30和KYSE180细胞的增殖活性(P<0.05);而过表达CARLo-5基因对KYSE30和KYSE180细胞的增殖具有促进作用(P<0.05)。Transwell和划痕愈合实验结果显示,敲低CARLo-5基因能抑制食管癌KYSE30和KYSE180细胞迁移和侵袭能力(P<0.05),过表达CARLo-5基因能够促进KYSE30和KYSE180细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05)。3流式细胞术检测结果显示,与对照组相比,敲低CARLo-5基因后KYSE30和KYSE180细胞的早期凋亡率增高(P<0.05);G1期细胞比例均显著增加(P<0.05),S期细胞比例均显著降低(P<0.05)。4 MTS分析结果显示,敲低CARLo-5基因可降低KYSE30和KYSE180细胞对5氟尿嘧啶的药物敏感性(P<0.05);流式细胞术法检测结果显示,过表达CARLo-5基因可降低5氟尿嘧啶处理后的KYSE30和KYSE180细胞凋亡率(P<0.05)。第二部分CARLo-5对食管癌细胞作用机制研究目的:研究CARLo-5与蛋白和micro RNA相互作用的机制从而探讨CARLo-5发挥的促癌作用的可能机制。方法:1应用Western blot法检测敲低CARLo-5基因表达对食管癌KYSE30和KYSE180细胞周期、侵袭迁移、凋亡相关蛋白表达水平的影响。2应用RNA pulldown实验、质谱检测、RIP实验及Western blot实验检测CARLo-5能否与PTBP1结合。3应用MTS法、Transwell迁移法检测敲低PTBP1基因,过表达CARLo-5基因同时敲低PTBP1基因对食管癌细胞增殖活性和迁移能力的影响。4应用Western blot法检测食管癌细胞经放线菌酮处理后,或经Mg132联合放线菌酮处理后,过表达CARLo-5基因对PTBP1蛋白表达水平的影响。5应用Western blot法检测敲低PTBP1基因对KYSE30和KYSE180细胞凋亡相关蛋白和代谢相关蛋白表达水平的影响。6应用Realtime-PCR法检测食管癌细胞中敲低和过表达CARLo-5基因后不同micro RNA的表达变化,并筛选出差异显著的mi R-218-5p进行后续研究。7应用MTS法、Transwell迁移、Matrigel侵袭和划痕愈合实验检测敲低/过表达mi R-218-5p对食管癌细胞增殖活性、侵袭和迁移能力的影响。8应用MTS法、Transwell迁移法检测过表达CARLo-5基因同时敲低mi R-218-5p对食管癌细胞增殖和迁移能力的影响。9应用Realtime-PCR法检测食管癌细胞中敲低和过表达mi R-218-5p后靶基因的表达变化,并筛选出差异显著的靶基因进行后续研究。10应用Western blot法检测敲低和过表达mi R-218-5p后对KYSE30和KYSE180细胞ROBO1、BMI1、RELN蛋白表达水平的影响。结果:1 Western blot实验结果显示,敲低CARLo-5可诱导KYSE30和KYSE180周期相关蛋白cyclin B1、cyclin D1、CDK2、CDK4表达水平降低,P21表达水平增高(P<0.05);侵袭迁移相关蛋白MMP9和MMP2表达水平降低(P<0.05);凋亡相关蛋白MCL-1表达水平降低(P<0.05),Caspase-3表达水平增高(P<0.05)。2 RNA pulldown、联合质谱分析、RIP和Western blot实验结果显示,CARLo-5在食管癌细胞中能够与PTBP1蛋白相结合。3 MTS法检测结果显示,与对照组相比,敲低PTBP1基因可抑制KYSE30和KYSE180细胞增殖(P<0.05);Transwell迁移结果显示,敲低PTBP1基因可抑制KYSE30和KYSE180细胞迁移能力(P<0.05)。4 MTS法检测结果显示,敲低PTBP1基因能够降低CARLo-5过表达对KYSE30和KYSE180细胞增殖的增强作用(P<0.05);Transwell迁移结果显示,敲低PTBP1基因能够降低CARLo-5过表达对KYSE30和KYSE180细胞迁移能力的增强作用(P<0.05)。5 Western blot法分析结果显示,KYSE30和KYSE180细胞经放线菌酮处理后,与对照组相比,过表达CARLo-5可降低PTBP1降解程度(P<0.05)。6 Western blot法分析结果显示,KYSE30和KYSE180细胞经MG132联合放线菌酮处理后,与对照组相比,PTBP1蛋白表达水平无明显差异。7 Western blot实验结果显示,敲低PTBP1基因可促进KYSE30和KYSE180细胞PKM2蛋白水平降低,Mcl-1、PKM1蛋白水平升高(P<0.05)。8 Realtime-PCR实验结果显示,敲低和过表达CARLo-5后KYSE30和KYSE180细胞中mi R-218-5p表达水平分别增高和降低(P<0.05)。9 MTS法检测结果显示,敲低mi R-218-5p可促进KYSE30和KYSE180细胞增殖活性(P<0.05);而过表达mi R-218-5p对KYSE30和KYSE180细胞增殖具有抑制作用(P<0.05)。Transwell和划痕愈合实验结果显示,敲低mi R-218-5p表达能促进KYSE30和KYSE180细胞迁移和侵袭能力,过表达mi R-218-5p能抑制KYSE30和KYSE180细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05)。10 MTS法检测结果显示,敲低mi R-218-5p表达能够部分降低CARLo-5过表达对KYSE30和KYSE180细胞增殖的增强作用(P<0.05);Transwell迁移结果显示,敲低mi R-218-5p表达能够部分降低CARLo-5过表达对KYSE30和KYSE180细胞迁移能力的增强作用(P<0.05)。11 Realtime-PCR实验结果显示,敲低mi R-218-5p和过表达mi R-218-5p后KYSE30和KYSE180细胞中ROBO1、BMI1、RELN蛋白表达水平分别增高和降低(P<0.05)。12 Western blot实验结果显示,在KYSE30和KYSE180细胞中敲低mi R-218-5p和过表达mi R-218-5p后可显著影响ROBO1蛋白表达水平分别增高和降低(P<0.05),BMI1和RELN蛋白表达水平无明显改变。第三部分CARLo-5对食管癌细胞裸鼠种植瘤的影响目的:研究CARLo-5在体内对食管癌增殖的影响。方法:1构建稳定敲低CARLo-5的食管癌细胞,进行裸鼠皮下种植瘤实验,并观察种植瘤的生长情况。2应用免疫组织化学法检测裸鼠种植瘤组织中PTBP1的表达情况。结果:1与对照组相比,sh-CARLo-5组裸鼠皮下种植瘤增长速度显著下降(P<0.05)。2免疫组织化学结果显示,敲低CARLo-5组的裸鼠种植瘤组织中PTBP1的表达水平明显低于对照组。结论:食管癌组织和细胞中CARLo-5的表达水平上调,且在体内外促进食管癌细胞的增殖活性,在体外还能促进食管癌细胞的迁移和侵袭能力,并通过与增加PTBP1蛋白的稳定性和形成mi-218-5p的sponge从而影响食管癌的进展。