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研究目的：
睾丸间质细胞与男性生殖健康息息相关，作为男性生殖的重要内分泌细胞，其发育过程受多种调节因子的影响，但其中的具体发育调控过程尚不清楚。抑瘤素M（OSM）是细胞因子IL-6家族内的一种多效细胞因子，其参与调节多种生物系统中的细胞生长和分化过程。我们推测OSM是调控睾丸间质细胞发育的重要潜在因子。本研究探讨了OSM对大鼠睾丸间质干细胞发育的影响，并对睾丸间质细胞的发育机制进行了深入研究，为进一步揭示各种生殖功能障碍奠定了基础。
研究方法：
体外实验：我们使用体外曲细精管培养系统。在本实验中，我们通过腹腔内注射二甲磺酸乙烷（Ethanedimethanesulfonate，EDS）来消除大鼠睾丸中的睾丸间质细胞，在腹腔注射EDS后第4天处死大鼠，取大鼠睾丸，分离曲细精管，随后在体外培养曲细精管，诱导睾丸间质干细胞的增殖和分化。睾丸间质干细胞可在体外于睾丸间质干细胞分化诱导剂（LDM培养基，含LH+Li）中培养分化而产生睾酮。我们向培养基中加入不同浓度的OSM（0、0.1、1、10和100ng/ml）来处理培养的曲细精管，然后通过化学发光法测量培养基的睾酮；收集曲细精管并提取RNA，通过qPCR测量雄激素相关合成基因的mRNA；收集曲细精管并提取蛋白，通过Westernblot（WB）测量睾丸间质细胞特异性蛋白水平。另外重新培养一批大鼠曲细精管，通过Click-iTEdU掺入标记增殖细胞来研究OSM对大鼠睾丸间质干细胞增殖的影响；采用OSM的特异性抑制剂S3I-201、Filgotinib与OSM共处理来进一步探究OSM的作用。
体内实验：我们使用EDS处理的大鼠睾丸间质细胞再生模型进行研究。18只成年雄性SD大鼠腹腔注射EDS（75mg/kg），然后随机分为3组（每组6只）：0（生理盐水组）、10ng/睾丸OSM组、100ng/睾丸OSM组。在EDS处理后第14天开始连续睾丸内注射生理盐水或OSM（10和100ng/睾丸）14天，在EDS处理后第28天处死大鼠，取其血清和睾丸并称重。使用化学发光法检测分析血清的睾酮（T）水平，通过ELISA法检测血清中促黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）水平；取睾丸组织提取RNA，通过qPCR测量雄激素合成相关基因的表达水平；取睾丸组织提取蛋白，通过WB测量睾丸间质细胞特异性蛋白的表达水平。此外，另取一只睾丸用Bouins液固定，通过免疫组化染色睾丸间质细胞，计算睾丸间质细胞的数目；通过基因测序测量OSM处理后的睾丸mRNA的表达水平并分析OSM的作用通路。
研究结果：
体外研究表明，OSM剂量依赖性的抑制了培养基中睾酮的水平及雄激素生成相关基因（Lhcgr、Scarb1、Cyp11a1、Hsd3b1和Star）的表达水平。此外，OSM的作用效果可以被S3I-201或Filgotinib拮抗，这些数据提示OSM可能通过JAK1-STAT3信号转导途径阻断睾丸间质干细胞的分化。我们测量了Lhcgr、Scarb1、Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Cyp17a1、Hsd17b3、Srd5a1和Hsd11b1的mRNA水平。结果显示10ng/ml的OSM下调Lhcgr、Scarb1和Star的表达水平，100ng/ml的OSM下调了Cyp11a1、Hsd3b1和Cyp17a1的表达水平。曲细精管经OSM处理后，EdU掺入率没有改变，提示OSM不影响睾丸间质干细胞的增殖。将睾丸间质干细胞用含OSM的培养基处理一周，然后与睾丸间质干细胞分化诱导剂一起培养两周，培养基中睾酮的水平没有明显变化，也提示OSM不影响睾丸间质干细胞的增殖。
体内实验表明，OSM不影响大鼠的体重及睾丸重量。在EDS处理后第28天，OSM抑制了大鼠血清中睾酮的水平，但不影响血清LH及FSH的水平。qPCR结果显示，OSM（10ng/睾丸）显著降低Lhcgr、Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Cyp17a1和Hsd11b1的表达水平。WB结果显示OSM降低LHCGR、CYP11A1、HSD3B1、CYP17A1和HSD11B1的蛋白表达水平。免疫组织化学染色（CYP11A1及HSD11B1）结果表明OSM不改变睾丸间质细胞的数目。此外，PCNA（增殖细胞核抗原）和CYP11A1（睾丸间质细胞标记物）的双重染色显示睾丸间质细胞数目没有明显变化。这说明OSM不影响睾丸间质细胞的增殖。对基因测序的结果分析表明，共有997个基因显著上调，731个基因显著下调。我们通过IL6ST-JAK-STAT3途径检测OSM的信号通路，发现OSM下游基因（Shc1、Fyn、Prk2b、Inppl1、Gsk3b和Pxn）的表达显著上调超过1.5倍，这提示OSM可能激活OSM受体-IL6ST-JAK-STAT3信号通路。
结论：体内和体外的实验数据表明，OSM在大鼠睾丸间质干细胞发育期间抑制了睾丸间质干细胞的分化但不影响其增殖，此结果可能通过OSM受体-IL6ST-JAK-STAT3信号传导途径进行调控。
睾丸间质细胞与男性生殖健康息息相关，作为男性生殖的重要内分泌细胞，其发育过程受多种调节因子的影响，但其中的具体发育调控过程尚不清楚。抑瘤素M（OSM）是细胞因子IL-6家族内的一种多效细胞因子，其参与调节多种生物系统中的细胞生长和分化过程。我们推测OSM是调控睾丸间质细胞发育的重要潜在因子。本研究探讨了OSM对大鼠睾丸间质干细胞发育的影响，并对睾丸间质细胞的发育机制进行了深入研究，为进一步揭示各种生殖功能障碍奠定了基础。
研究方法：
体外实验：我们使用体外曲细精管培养系统。在本实验中，我们通过腹腔内注射二甲磺酸乙烷（Ethanedimethanesulfonate，EDS）来消除大鼠睾丸中的睾丸间质细胞，在腹腔注射EDS后第4天处死大鼠，取大鼠睾丸，分离曲细精管，随后在体外培养曲细精管，诱导睾丸间质干细胞的增殖和分化。睾丸间质干细胞可在体外于睾丸间质干细胞分化诱导剂（LDM培养基，含LH+Li）中培养分化而产生睾酮。我们向培养基中加入不同浓度的OSM（0、0.1、1、10和100ng/ml）来处理培养的曲细精管，然后通过化学发光法测量培养基的睾酮；收集曲细精管并提取RNA，通过qPCR测量雄激素相关合成基因的mRNA；收集曲细精管并提取蛋白，通过Westernblot（WB）测量睾丸间质细胞特异性蛋白水平。另外重新培养一批大鼠曲细精管，通过Click-iTEdU掺入标记增殖细胞来研究OSM对大鼠睾丸间质干细胞增殖的影响；采用OSM的特异性抑制剂S3I-201、Filgotinib与OSM共处理来进一步探究OSM的作用。
体内实验：我们使用EDS处理的大鼠睾丸间质细胞再生模型进行研究。18只成年雄性SD大鼠腹腔注射EDS（75mg/kg），然后随机分为3组（每组6只）：0（生理盐水组）、10ng/睾丸OSM组、100ng/睾丸OSM组。在EDS处理后第14天开始连续睾丸内注射生理盐水或OSM（10和100ng/睾丸）14天，在EDS处理后第28天处死大鼠，取其血清和睾丸并称重。使用化学发光法检测分析血清的睾酮（T）水平，通过ELISA法检测血清中促黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）水平；取睾丸组织提取RNA，通过qPCR测量雄激素合成相关基因的表达水平；取睾丸组织提取蛋白，通过WB测量睾丸间质细胞特异性蛋白的表达水平。此外，另取一只睾丸用Bouins液固定，通过免疫组化染色睾丸间质细胞，计算睾丸间质细胞的数目；通过基因测序测量OSM处理后的睾丸mRNA的表达水平并分析OSM的作用通路。
研究结果：
体外研究表明，OSM剂量依赖性的抑制了培养基中睾酮的水平及雄激素生成相关基因（Lhcgr、Scarb1、Cyp11a1、Hsd3b1和Star）的表达水平。此外，OSM的作用效果可以被S3I-201或Filgotinib拮抗，这些数据提示OSM可能通过JAK1-STAT3信号转导途径阻断睾丸间质干细胞的分化。我们测量了Lhcgr、Scarb1、Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Cyp17a1、Hsd17b3、Srd5a1和Hsd11b1的mRNA水平。结果显示10ng/ml的OSM下调Lhcgr、Scarb1和Star的表达水平，100ng/ml的OSM下调了Cyp11a1、Hsd3b1和Cyp17a1的表达水平。曲细精管经OSM处理后，EdU掺入率没有改变，提示OSM不影响睾丸间质干细胞的增殖。将睾丸间质干细胞用含OSM的培养基处理一周，然后与睾丸间质干细胞分化诱导剂一起培养两周，培养基中睾酮的水平没有明显变化，也提示OSM不影响睾丸间质干细胞的增殖。
体内实验表明，OSM不影响大鼠的体重及睾丸重量。在EDS处理后第28天，OSM抑制了大鼠血清中睾酮的水平，但不影响血清LH及FSH的水平。qPCR结果显示，OSM（10ng/睾丸）显著降低Lhcgr、Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Cyp17a1和Hsd11b1的表达水平。WB结果显示OSM降低LHCGR、CYP11A1、HSD3B1、CYP17A1和HSD11B1的蛋白表达水平。免疫组织化学染色（CYP11A1及HSD11B1）结果表明OSM不改变睾丸间质细胞的数目。此外，PCNA（增殖细胞核抗原）和CYP11A1（睾丸间质细胞标记物）的双重染色显示睾丸间质细胞数目没有明显变化。这说明OSM不影响睾丸间质细胞的增殖。对基因测序的结果分析表明，共有997个基因显著上调，731个基因显著下调。我们通过IL6ST-JAK-STAT3途径检测OSM的信号通路，发现OSM下游基因（Shc1、Fyn、Prk2b、Inppl1、Gsk3b和Pxn）的表达显著上调超过1.5倍，这提示OSM可能激活OSM受体-IL6ST-JAK-STAT3信号通路。
结论：体内和体外的实验数据表明，OSM在大鼠睾丸间质干细胞发育期间抑制了睾丸间质干细胞的分化但不影响其增殖，此结果可能通过OSM受体-IL6ST-JAK-STAT3信号传导途径进行调控。