论文部分内容阅读
目的:本文旨在探讨质子泵抑制剂兰索拉唑(Lansoprazole,Lpz)对非小细胞肺癌A549细胞的抗肿瘤作用及分子机理,进一步研究兰索拉唑与吉非替尼(Gefitinib,Gef)联合应用在体内和体外对A549细胞的协同抗肿瘤作用及机制。方法:1.MTT实验检测兰索拉唑对A549细胞增殖活性的影响。流式细胞术检测兰索拉唑对A549细胞周期分布的影响。免疫印迹分析法(Western-blot)实验检测兰索拉唑对A549细胞周期相关蛋白Cyclin D1、Rb、p27的影响。流式细胞术检测兰索拉唑对A549细胞凋亡的影响。Western-blot实验检测兰索拉唑对A549细胞凋亡相关蛋白PARP活化的影响。2.细胞划痕实验检测兰索拉唑对A549细胞迁移能力的影响。Western-blot实验检测兰索拉唑对A549细胞中整合素Integrinβ1磷酸化水平的影响。3.MDC实验检测兰索拉唑处理A549细胞对自噬泡数量的影响。Western-blot实验检测自噬相关蛋白LC3BⅠ向LC3BⅡ的转化。经m RFP-GFP-LC3质粒转染的A549细胞,兰索拉唑处理后,在共聚焦显微镜下观察自噬流的顺畅程度。Western-blot分析Baf-A1与兰索拉唑共同处理A549细胞对p62蛋白的影响,侧面验证兰索拉唑发挥抑制自噬的作用。4.Western-blot分析兰索拉唑作用A549细胞48 h后,对信号转换和转录激活因子3(Signal transducing activator of transcription 3,Stat3)磷酸化水平的影响;兰索拉唑对A549细胞中磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)通路(PI3K/Akt通路)的影响;兰索拉唑对A549细胞中小G蛋白Ras、c-Raf(Rapidly accelerated fibrosarcoma)、细胞外调节蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases,ERK)通路(Ras/Raf/ERK通路)相关蛋白表达和磷酸化水平的影响。5.Chou-Talalay法研究兰索拉唑联合吉非替尼对A549细胞增殖活性的影响。在不同联合比例下,求得联合给药指数(Fa-CI值),分析兰索拉唑联合吉非替尼是否协同抗肿瘤。6.流式细胞术检测兰索拉唑联合吉非替尼对A549细胞周期分布和凋亡的影响。Western-blot技术分析两药联合对周期和凋亡相关蛋白的影响。Western-blot技术分析两药联合对A549细胞PI3K/Akt和Ras/Raf/ERK通路相关蛋白的影响。7.小鼠异体移植瘤实验分析兰索拉唑与吉非替尼联合对肿瘤生长的影响。结果:1.兰索拉唑浓度和时间依赖性地抑制A549细胞增殖,作用48 h,IC50为110.4μM。兰索拉唑将A549细胞周期阻滞于G0/G1期,Western-blot分析发现周期相关蛋白Cyclin D1的表达降低,Rb的磷酸化水平降低,p27的表达增加。200μM兰索拉唑处理A549细胞,通过PARP裂解活化来诱导A549细胞凋亡。低于IC50浓度的兰索拉唑抑制A549细胞迁移,抑制整合素Integrinβ1磷酸化水平。兰索拉唑诱导自噬泡生成,但抑制自噬流过程,即类似Baf-A1发挥抑制自噬的作用。2.兰索拉唑抑制A549细胞中Stat3磷酸化,降低PI3K-p110α、PI3K-p110β、Akt的表达,降低Akt(Ser473)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白m TOR(Ser2448)、核糖体S6蛋白激酶(p70 S6 Kinase,p70 S6K)、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)的磷酸化水平。兰索拉唑抑制A549细胞中K-Ras表达,抑制c-Raf、ERK的磷酸化水平。即兰索拉唑可能通过抑制PI3K/Akt和Ras/Raf/ERK信号通路抑制细胞增殖和迁移。3.兰索拉唑联合吉非替尼在IC50 Lpz?IC50 Gef和1/2×IC50 Lpz?IC50 Gef比例下协同抑制A549细胞增殖。两药联合将A549细胞周期阻滞于G0/G1期的作用加强,对周期相关蛋白的作用加强。两药联合通过线粒体途径诱导细胞凋亡。兰索拉唑联合吉非替尼对A549细胞中PI3K/Akt和Ras/Raf/ERK通路相关蛋白的抑制作用增强,通过此作用抑制周期和凋亡相关蛋白的活化,增强细胞周期阻滞和诱导凋亡作用。兰索拉唑联合吉非替尼抑制小鼠异体移植瘤的生长,对小鼠体重无影响。