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本论文以辽春9号小麦面粉为植物酯酶(plantesterase,P-E)的提取原料,利用植物酯酶活性可被有机磷农药所抑制的毒理机制,提取纯化一种灵敏度及纯度高的植物酯酶。植物酯酶可水解醋酸萘酯为萘酚和醋酸,萘酚与固蓝B盐反应生成紫红色偶氮化合物,从而完成显色反应。当样品中含有机磷农药时,植物酯酶的活性就被抑制,就不能完成显色反应。
植物酯酶粗酶液提取方法的具体步骤为:称取1g小麦面粉,加入5mLpH值6.5的磷酸缓冲溶液,在30℃恒温水浴摇床上振荡提取40min,然后用高速冷冻离心机在4℃下离心5min(10,000rpm),所得上清液即为植物酯酶粗酶液。将所得粗酶液保存在4℃冰箱(或将酶液分装后在真空冷冻干燥机上干成酶干粉冰冻保存)。通过实验得:粗酶的最适反应温度为40℃,最适反应pH为6.5,10%粗酶最适反应时间为10min。双水相法萃取植物酯酶的最适条件是:10g的双水相体系中含有13%的硫酸铵,27%的聚乙二醇1000,1mL的植物酯酶粗酶液,1mLpH值为7.5的磷酸缓冲溶液和双重蒸馏水。在此条件下提取的植物酯酶分配系数Ke达到10.2462,总蛋白的分配系数Kp为2.3160,酶活回收率η为94.8%,,萃取效果最佳。
粗酶液经过DEAE-纤维素52、SephadexG-200柱层析,第一组分纯化了4.9771倍,活力回收20.09%;第二组分纯化了1.5276倍,活力回收8.55%。通过实验确定了植物酯酶的纯化条件:以双重蒸馏水平衡DEAE-纤维素柱2-5h,上样后,分别以双重蒸馏水、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/的NaCl进行梯度洗脱,通过酯酶的显色反应可知双重蒸馏水及0.2mol/LNaCl洗脱得两组分为所需酶液;以0.2mol/L的NaCl为平衡液将SephadexG-200柱平衡2-5h,将经DEAE-52柱层析所得两组分分别上样后,以0.2mol/L的NaCl溶液进行洗脱分别得三个组分,其中所得第一组分均为所需组分。
比较了双水相萃取植物酯酶和柱层析纯化植物酯酶的纯化倍数,其中双水相萃取法酶的纯化倍数是7.6772倍左右,柱层析纯化植物酯酶的纯化倍数是4.9771倍左右。粗酶液、双水相萃取酶液、经DEAE-52所得两组分及SephadexG-200所得的六个组分经聚丙烯酰铵电泳看其纯度。最终确定所提取植物酯酶的分子量在29KD左右。植物酯酶的检测系统的最适条件是:底物乙酸-1-萘酯0.1mL,显色剂固蓝B盐0.9mL,酶液1.0mL,pH值6.5的磷酸缓冲溶液1.0mL,双重蒸馏水1.0mL,反应温度是40℃,反应时间是10min。
采用丙酮做溶剂分别将五种有机磷农药配制成W=1%的农药标准溶液,然后采用梯度稀释法在双重蒸馏水中分别配制10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11(V/V)的系列浓度的标准溶液,利用提取出来不同纯化程度的酶液分别进行检测试验,待反应完成后用10%抑制率,分别确定出各种酶液的最低农药浓度,结果如下:粗酶及10%粗酶的检出限均为10-6(V/V),但后者的抑制率要比前者高,其中10%的粗酶液检测敌敌畏的灵敏度最高;利用双水相萃取所得酶液检测敌敌畏的检出限为10-9(V/V);利用硫酸铵沉淀法再经透析所得酶液检测敌敌畏的检出限为10-7(V/V);利用DEAE-52纤维素分离所得Ⅰ组分酶液检测敌敌畏的检出限为10-8(V/V)。