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金黄色葡萄球菌(S.aureus)是奶牛乳腺炎中常见的病原菌之一,常引起慢性乳腺内感染,带来巨大的经济损失。硒(Se)是哺乳动物必需的微量元素之一,通过硒蛋白的形式参与体内氧化还原系统和免疫系统的调节。硒代蛋氨酸(SeMet)是生产中常用的一种硒添加剂,与传统无机硒相比,具有低毒性和高生物利用率的特点。因此,本试验旨在研究SeMet对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)抗氧化能力的影响,以及其在S.aureus感染BMECs过程中的调节作用,为临床上防治S.aureus引发的奶牛乳腺炎提供理论依据。(1)为探究SeMet对BMECs抗氧化能力的影响,添加不同浓度的SeMet与BMECs共孵育24 h,检测主要抗氧化酶活力与细胞活性氧(ROS)水平;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测主要硒蛋白基因及Nrf2信号通路相关基因表达。试验结果显示:2、4和8 μmol/L的SeMet极显著增强了 BMECs中谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、超氧化物歧化酶(SOD)的活力和总抗氧化能力(T-AOC)(p<0.01);此外,4和8μmol/L的SeMet极显著增强了过氧化氢酶(CAT)活性(p<0.01)。2、4和8 μmol/L的SeMet极显著上调了 GPX1、GPX4和SELENOP基因的表达(p<0.01)。4和8 μmol/L的SeMet显著或极显著上调了 TRXR1、NRF2和HO-1基因的表达,显著或极显著下调了KEAP1基因的表达(p<0.05或p<0.01);此外,2 μmol/L的SeMet极显著上调了NQO-1基因的表达(p<0.01)。(2)为探究S.aureus感染对BMECs的氧化应激和炎症影响,本试验使用S.aureus以MOI=1:1接种BMECs,建立细胞感染模型。分别于感染后2、4、6和8h,检测细胞Nrf2信号通路相关基因表达,于感染后0.5、1、2、3、4、5和6h检测NF-κB信号通路相关蛋白表达,于感染后0.5、1、2、3、4、6和8h检测相关炎性因子水平。结果显示:与对照组相比,在感染后2和4h,NRF2基因表达极显著升高(p<0.01),KEAP1基因表达显著或极显著下降(p<0.05或p<0.01);在感染后6和8h,NRF2基因表达极显著下降(p<0.01);在感染后8 h,KEAP1基因表达显著升高(p<0.05)。同时,与对照组相比,在感染后0.5、1、2、3、4、5和6h,p65蛋白磷酸化水平显著或极显著升高(p<0.05或p<0.01);在感染后1、2、3和4h,IκBα蛋白磷酸化水平显著或极显著升高(p<0.05或p<0.01)。与对照组相比,在感染后1、2、3、4、6和8 h,炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-8基因表达显著或极显著上升(p<0.05或p<0.01)。(3)为探究SeMet对S.aureus感染BMECs的氧化应激与炎症的影响,使用4μmol/L的SeMet与BMECs共孵育后,建立S.aureus感染模型。在感染后8h,检测细胞抗氧化酶活力、ROS水平及线粒体膜电位(MMP)变化,荧光染色观察细胞内Nrf2蛋白定位,qRT-PCR检测硒蛋白基因和Nrf2信号通路相关基因的表达;在感染后3h,qRT-PCR检测相关炎性细胞因子表达和NF-κB信号通路相关蛋白表达。结果显示:与S.aureus组相比,SeMet干预组的ROS水平显著下降(p<0.05),MMP显著升高(p<0.05),NRF2、HO-1、GPX1、GPX4、SELENOP 和 TRXR1 的基因表达显著或极显著升高(p<0.05或p<0.01),KEAP1的基因表达极显著下降(p<0.01)。与空白组相比,S.aureus组的核内荧光强度减弱;与S.aureus组相比,SeMet干预组的核内荧光增强。与S.aureus组相比,SeMet干预组TNF-α、IL-1β和IL-8的基因表达极显著下降(p<0.01),p65和IκBα蛋白磷酸化水平极显著下降(p<0.01)。综上所述,SeMet增强BMECs抗氧化酶活性,通过调节Nrf2信号通路和硒蛋白基因的转录,提高BMECs的抗氧化能力。当S.aureus感染BMECs时,NF-κB信号通路被激活,而Nrf2信号通路先被激活随后被抑制。同时,SeMet的干预通过调节NF-κB信号通路减轻了炎症损伤;SeMet通过促进硒蛋白相关基因的转录,增强了抗氧化酶活力,并通过调节Nrf2信号通路缓解了S.aureus感染导致的BMECs的氧化应激。该结论为临床S.aureus性乳腺炎的预防和支持治疗提供了新思路。