论文部分内容阅读
目的:研究阿司匹林诱生型脂氧素A4(aspirin-triggered lipoxin A4, ATL)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小胶质细胞炎症介质的产生及其mRNA的表达的影响,以探讨ATL对小胶质细胞炎症反应的影响及其机制。方法:以100ng/ml的LPS刺激体外培养的BV-2细胞作为炎症模型,根据药物不同将细胞分为5组:⑴对照组:用含0.035%乙醇的无血清培养基处理;⑵ATL组:用含不同浓度ATL(1nM、10nM、100nM)的无血清培养基处理;⑶LPS组:用含0.035%乙醇的无血清培养基处理30min后加终浓度为100ng/ml的LPS处理;⑷ATL+LPS组:用含不同浓度ATL(1nM、10nM、100nM)的无血清培养基处理30min后加终浓度为100ng/ml的LPS处理。⑸Boc-2+ATL+LPS组:在用ATL和LPS处理前加100μM Boc-2处理30min。逆转录PCR检测BV-2细胞脂氧素A4受体(lipoxin A4 receptor, ALX)基因水平的表达;采用MTT法测定各组细胞活力;ELISA法检测细胞培养上清中白介素-1β(interleukin-1 beta, IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)的浓度;硝酸还原酶法测定细胞培养上清中一氧化氮(nitric oxide, NO)的浓度;Western blotting检测细胞诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)蛋白表达;real-time PCR检测细胞iNOS、IL-1β和TNF-αmRNA的表达水平。结果:BV-2小胶质细胞在mRNA水平表达ALX(ALX1/FPR-rs1和ALX2/FPR2),LPS刺激6h可上调其表达(P<0.05)。不同浓度的ATL对LPS刺激24h的BV-2细胞活力无显著的影响(P>0.05)。100ng/ml LPS刺激BV-2细胞24h,细胞培养上清中的NO、IL-1β和TNF-α水平均显著升高(P<0.01)。10nM和100nM ATL能够抑制LPS诱导的NO、IL-1β和TNF-α产生(P<0.01);1nM ATL对炎症相关介质的产生无明显影响(P>0.05)。ALX拮抗剂Boc-2能显著阻断ATL的抗炎效应。与对照组相比,100ng/ml LPS刺激BV-2细胞6h,iNOS、IL-1β和TNF-αmRNA的表达水平均显著升高(P<0.01)。与LPS组相比,10nM和100nM国AT家L自能然降科低学基LP金S项诱目发(的30 i7N00O7S84、)IL资-1助β和TNF-αmRNA的表达水平上调(P<0.01)。结论:ATL可抑1制LPS诱导的小胶质细胞炎症介质NO、IL-1β和TNF-α的产生。ATL的抗炎作用可能是通过抑制炎症介质的基因表达来实现的。目的:研究阿司匹林诱生型脂氧素A4(aspirin-triggered lipoxin A4, ATL)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小胶质细胞炎症介质的产生及其mRNA的表达的影响,以探讨ATL对小胶质细胞炎症反应的影响及其机制。方法:以100ng/ml的LPS刺激体外培养的BV-2细胞作为炎症模型,根据药物不同将细胞分为5组:⑴对照组:用含0.035%乙醇的无血清培养基处理;⑵ATL组:用含不同浓度ATL(1nM、10nM、100nM)的无血清培养基处理;⑶LPS组:用含0.035%乙醇的无血清培养基处理30min后加终浓度为100ng/ml的LPS处理;⑷ATL+LPS组:用含不同浓度ATL(1nM、10nM、100nM)的无血清培养基处理30min后加终浓度为100ng/ml的LPS处理。⑸Boc-2+ATL+LPS组:在用ATL和LPS处理前加100μM Boc-2处理30min。逆转录PCR检测BV-2细胞脂氧素A4受体(lipoxin A4 receptor, ALX)基因水平的表达;采用MTT法测定各组细胞活力;ELISA法检测细胞培养上清中白介素-1β(interleukin-1 beta, IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)的浓度;硝酸还原酶法测定细胞培养上清中一氧化氮(nitric oxide, NO)的浓度;Western blotting检测细胞诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)蛋白表达;real-time PCR检测细胞iNOS、IL-1β和TNF-αmRNA的表达水平。结果:BV-2小胶质细胞在mRNA水平表达ALX(ALX1/FPR-rs1和ALX2/FPR2),LPS刺激6h可上调其表达(P<0.05)。不同浓度的ATL对LPS刺激24h的BV-2细胞活力无显著的影响(P>0.05)。100ng/ml LPS刺激BV-2细胞24h,细胞培养上清中的NO、IL-1β和TNF-α水平均显著升高(P<0.01)。10nM和100nM ATL能够抑制LPS诱导的NO、IL-1β和TNF-α产生(P<0.01);1nM ATL对炎症相关介质的产生无明显影响(P>0.05)。ALX拮抗剂Boc-2能显著阻断ATL的抗炎效应。与对照组相比,100ng/ml LPS刺激BV-2细胞6h,iNOS、IL-1β和TNF-αmRNA的表达水平均显著升高(P<0.01)。与LPS组相比,10nM和100nM国AT家L自能然降科低学基LP金S项诱目发(的30 i7N00O7S84、)IL资-1助β和TNF-αmRNA的表达水平上调(P<0.01)。和AP-1的DNA结合活性增加。结论:ATL可抑制LPS诱导的小胶质细胞IκB降解、抑制NF-κB核转位以及ERK1/2、p38磷酸化、抑制NF-κB和AP-1的转录活性。因此,ATL发挥抗炎作用可能是通过抑制NF-κB和MAPK/AP-1信号通路实现的。目的:研究ATL对LPS诱导的小胶质细胞活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)产生的影响,探讨ATL在小胶质细胞发挥抗氧化的机制。方法:以100ng/ml的LPS刺激体外培养的BV-2细胞作为炎症模型,根据药物不同将细胞分为4组:⑴对照组:用含0.035%乙醇的无血清培养基处理;⑵ATL组:用含100nM ATL的无血清培养基处理;⑶LPS组:用含0.035%乙醇的无血清培养基处理30min后加终浓度为100ng/ml的LPS处理;⑷ATL+LPS组:用100nM ATL的无血清培养基处理30min后加终浓度为100ng/ml的LPS处理。采用荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS的水平;激光共聚焦显微镜检测血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)的表达;Western blotting检测细胞HO-1的表达、核因子红系-2p45相关因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2, Nrf2)的表达及其核转位。结果:100ng/ml LPS诱导BV-2细胞ROS水平增高,12h达到峰值;100nM ATL预处理30min可显著减少ROS产生。ATL可时间依赖性、剂量依赖性地上调HO-1蛋白表达,100nM ATL作用24h达到峰值。免疫荧光结果表明,100nM ATL处理细胞24h后,HO-1荧光强度显著增强。Western blotting结果显示,100nM ATL处理细胞可时间依赖性地上调Nrf2蛋白表达;此外,ATL在短时间(120min)内即可诱导Nrf2蛋白核转位并增强LPS诱导的Nrf2核转位。结论:ATL能够抑制LPS诱导的BV-2细胞ROS产生。ATL的抗氧化作用可能是通过增强Nrf2蛋白表达及其核转位、诱导HO-1蛋白表达实现的。