近年来,蛋白质的拓扑工程及拓扑蛋白合成机制引起广泛关注。本文就这两个问题分别进行了研究。1.蛋白质拓扑工程的应用体现了在改变蛋白质稳定性和功能的良好成果。受自然界启发,在此领域中,经常采用主链环化来增强肽天然产物和非热稳定酶的稳定性。本文中,我们基于拓扑结构改造的理念,通过构建蛋白质链式锁链对一种工业热不稳定的γ-内酰胺酶进行蛋白质工程改造。我们通过SpyTag/SpyCatcher模块和两个不同的二聚体结构域成功构建了两个不同的catenanes。然后通过大肠杆菌生物合成两个功能性生物催化剂catenanes。比较生化特性表明,蛋白质拓扑在γ-内酰胺酶的稳定性中起关键作用,链烷套式蛋白可以增强目标酶的热稳定性和抗蛋白水解性。此外,与野生型酶相比,Catl-MhIHL-V54L和Cat2-MhIHL-V54L分别显示出3.2和3.8倍的酶效率(Kcat/Km)。因此,我们的研究证明,这种方法不同于常规诱变方案而实现,链烷套式蛋白的构建可以作为通过独特机制增强工业生物催化剂的一般策略而开发,并且可能可以在精细化工行业中得到广泛应用。2.拓扑蛋白除catenane形式外,还有套索肽类。套索肽属于核糖体合成和翻译后修饰的肽(RiPPs),具有独特的套索结拓扑结构。最近,通过激活链霉菌中沉默的生物合成基因簇(BGCs),发现了被羟基化修饰的套索肽canucin A。canucin A的C-末端β-OH-Asp修饰是本文第二个探究的主题。通过生化实验,我们证明了 Fe/20G依赖性酶CanE在体外将羟基基团安装到前体肽CanA上。对CanE的酶学性质结果显示,其最适催化温度为30℃,在pH 5-8范围的反应条件下其相对活性均在92%以上。最适反应条件下测得其Km值为0.24±0.02 mM,Kcat值为0.02 ±2.17*10-5 min-1。