疫霉属包括很多疫霉种，能够在全世界范围内引起农作物、观赏植物、林木作物的重要病害。由于疫霉菌引起的病害症状与其他病菌引起的症状相似，而且其分离和培养较困难。叶碟诱集与形态学鉴定等传统方法是生产上常用的检测技术，但是费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉菌的分离、形态学鉴定知识和丰富的经验，因此早期快速的对疫霉菌进行鉴定对疫病的控制起到很重要的作用。随着分子生物学技术的发展，普通PCR技术和实时荧光PCR技术已经成功用于检测疫霉菌。虽然这类方法具有快速、准确、灵敏且不需要进行病原菌的分离培养的特点，但是其检测时间仍然比较长，大概需要2-3h，同时PCR方法依赖精密的PCR基因扩增仪，相对价格较高，不适合用于基层、欠发达国家和地区。因此建立一种快速检测大豆疫霉菌的方法对植物疫病的控制非常重要。环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本荣研株式会社发明的一种新的核酸扩增技术，因其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代普通PCR的新的核酸扩增技术。本文利用环介导等温扩增技术检测疫霉菌，建立了一种快速、灵敏、特异、可视化的疫霉菌的LAMP检测方法;同时通过利用环介导等温扩增技术结合96孔板技术进行高通量疫霉菌的检测，为进一步建立其它病原菌的高通量检测提供了理论和实践意义。　　大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）侵染大豆（Glycine max）引起的疫霉根腐病是威胁全世界大豆生产的毁灭性病害之一，也是我国对外公布的植物检疫性病原菌。本文以环介导等温核酸扩增技术，建立了以Ypt1基因为靶标的简单、快速和灵敏的大豆疫霉菌的检测方法。Ypt1基因是一个Ras相关的基因，其在酵母中编码一个与Ras相关的GTP结合蛋白。Ypt1基因包含有多个内含子，其保守序列和进化区域相互间隔，适合作为疫霉菌分子检测的靶标。本研究中采用Ypt1基因作为靶标序列，利用LAMP技术，设计LAMP特异性引物，建立LAMP反应体系与条件，并进行灵敏度和特异性实验。结果表明整个检测过程仅需80min，即可通过肉眼直接目测实验结果。在等温条件下(64℃)进行核酸扩增反应80min，反应后经3种方法验证扩增结果：　　(1)浊度仪验证浊度变化;　　(2)琼脂糖凝胶进行电泳验证;　　(3)在扩增前加入染料HNB（羟基萘酚蓝）作为反应指示剂，根据HNB的颜色变化判定结果。　　特异性检测中，111个大豆疫霉菌株能够产生浊度曲线、扩增产生典型的梯形状条带，同时HNB显色观察到天蓝色的阳性反应，而从其它疫霉、腐霉和真菌供试菌株中均没有观察到这些现象。在灵敏度检测中，PsYpt1-LAMP技术最低检测限为100pgμL-1，普通PCR技术的最低检测限为1ngμL-1，LAMP方法检测灵敏度是普通PCR方法检测灵敏度的10倍。在田间应用方面，对来自黑龙江省份的部分地区的土样进行检测。LAMP检测技术法的阳性率为71/130(54.6％)、普通PCR法的阳性率为61/130(46.9％)和叶蝶诱捕法的阳性率为50/130(38.4％)，结果显示，PsYpt1-LAMP检测技术明显的提高了检测效率。同时，本研究建立的LAMP检测体系可用于口岸和田间对大豆疫霉菌的快速检测。　　在进行大豆疫霉功能基因组研究中发现无毒基因Avr3a的一段类转座子序列PsA3aPro，本研究根据类转座子序列PsA3aPro采用环介导等温核酸扩增技术，设计PsA3aPro-LAMP特异性引物，建立LAMP反应体系与条件，并进行灵敏度和特异性实验。结果表明整个检测过程仅需1h，即可通过可视化方法直接目测实验结果。在等温条件下(64℃)进行核酸扩增反应1h，反应后经3种方法验证扩增结果，在特异性实验中，111个大豆疫霉菌株能够产生浊度曲线、扩增产生典型的阶梯状的条带，同时HNB显色观察到天蓝色的阳性反应，而从其它疫霉、腐霉和真菌供试菌株中均没有观察到这些现象。在灵敏度试验中，PsA3aPro-LAMP技术最低检测限为10pgμL-1，Real-time PCR技术的最低检测限为10pgμL-1，LAMP方法检测灵敏度和Real-time PCR方法检测灵敏度相同。在田间应用方面，对来自黑龙江省份的部分地区的土样进行检测。LAMP检测技术法的阳性率为71/130(54.6％)、普通PCR法的阳性率为61/130(46.9％)和叶蝶诱捕法的阳性率为50/130(38.4％)。结果显示，PsA3aPro-LAMP检测技术明显的提高了检测效率。同时，本研究建立的LAMP检测体系可用于口岸和田间对大豆疫霉菌的快速检测。　　橡树疫霉引起的橡树猝死病导致美国西海岸橡树的成片猝死，目前控制其传播是减少危害的主要措施之一。本文也是首次报道应用环介导等温核酸扩增技术检测橡树疫霉菌。以橡树疫霉PrA3aPro作为研究靶标，设计了PrA3aPro-LAMP特异性引物，建立LAMP反应体系与条件，并进行灵敏度和特异性实验。结果表明整个检测过程仅需1h，即可通过肉眼直接目测实验结果。在等温条件下(64℃)进行核酸扩增反应1h，反应后经3种方法验证扩增结果，在特异性实验中，橡树疫霉菌株中能够产生浊度曲线、扩增到梯形状的条带，同时HNB显色观察到天蓝色的阳性反应，而从其它疫霉、腐霉和真菌供试菌株中均没有观察到这些现象。在灵敏度试验中，PrA3aPro-LAMP技术最低检测限为1ngμL-1。该方法的建立为橡树疫霉菌的检疫和其所致病害的快速诊断提供了新的检测技术。　　高通量检测是目前病原菌检测技术的发展方向，发展高通量的检测技术对于基层实验室和出入境口岸检疫具有重要的意义。在本文中，应用环介导等温核酸扩增技术结合96孔板的技术建立了一种能够同时检测8种疫霉种的高通量的检测技术。针对8种疫霉种（寄生疫霉Phytophthora parasitica、Phytophthora tentaculata、致病疫霉Phytophthora infestans、草莓疫霉Phytophthora fragariae、辣椒疫霉Phytophthora capsici、掘氏疫霉Phytophthora drechsleri、恶疫霉Phytophthora cactorum、大雄疫霉Phytophthora megasperma）的同一个靶标基因Ypt1建立了Ypt1-LAMP检测方法，在水浴锅内64℃扩增80min，扩增完成后肉眼观察可判定扩增结果。8种疫霉种的LAMP检测方法均只对靶病原体出现阳性结果，琼脂糖凝胶电泳显示为LAMP特异性的梯形状条带，同时在扩增前加入染料HNB（羟基萘酚蓝）作为反应指示剂，肉眼观察反应液变为天蓝色;8种疫霉种的LAMP检测方法的灵敏度为10ngμL-1-1ngμL-1不等;同时通过将LAMP技术和96孔相结合建立了高通量检测多种疫霉菌。本研究建立了基于LAMP技术的疫霉菌的分子检测体系，可以在一台水浴箱内同时对8种疫霉种进行高通量的分子鉴别检测，具有快速、不需要特殊仪器和肉眼判断结果的优势，适合基层单位的实验室和检验检疫机构开展分子检测和病害诊断。　　综上所述，本研究在国内外首次采用环介导等温扩增技术检测大豆疫霉菌和橡树疫霉菌，建立了一种快速、灵敏、特异、可视化的疫霉菌的LAMP检测方法。疫霉菌的LAMP检测方法在60min-80min内可完成待检样品检测过程，显著的缩短了检测时间，降低了基层部门的检测成本，其非常适合基层和出入境口岸等大批量样品的快速检测。同时基于以上的研究，本研究进一步建立了LAMP技术和96孔板相结合的高通量检测技术体系，为多种不同病原菌的高通量检测提供了很好的技术平台。