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研究背景全身麻醉药物以其特有的介导可逆性意识消失-恢复作用而被广泛应用于临床外科治疗中,然而其作用机制仍未得到阐明,已成为麻醉学领域亟待解决的重要科学问题之一。解析全麻药物的作用特点并阐明其核心机制,不仅对全身麻醉的应用产生深远影响,也极大推动了基础科学领域对认知、意识等复杂神经活动的理解。以往的研究表明,下丘脑外侧穹窿周围区(Perifornical area,Pef)Orexin能神经递质系统是调控全麻-觉醒意识转换的扳机。传统神经药理学研究进一步发现,基底前脑(Basal forebrain,BF)区外源性给予Orexin-A、Orexin-B两类神经递质可加速全麻后意识恢复,提示BF区是Orexin能神经递质系统调控全麻-觉醒意识转换的关键脑区。据此我们推测,BF区接收来自下丘脑Pef区Orexin能神经投射的直接支配,且该神经环路在全麻-觉醒意识转换中扮演重要作用。然而,以往的研究局限于外源性的药理学给药方式,无法排除外源性配体对受体系统的过度兴奋作用,无法模拟在体状态下生理性投射效应增强的效应,因此难以直接揭示Pef-BF神经环路内Orexin能神经系统在全麻引起的意识消失与恢复中所起的作用。故本课题通过构建转基因Hcrt-cre大鼠(可特异性标记Orexin能神经元),结合光遗传学等前沿神经生物学技术,探究在异氟醚麻醉下Pef-BF神经环路Orexin能神经投射调控全麻-觉醒意识转换的神经机制。研究目的(1)构建Hcrt-cre转基因大鼠,并验证基因敲入效率及特异性;(2)利用光遗传学手段,在体条件下特异性激活Pef区Orexin能神经元,观察Pef区Orexin能神经元对异氟醚麻醉下意识状态及脑电特征的影响;(3)利用光遗传学手段,在体条件下特异性激活Pef-BF神经环路中Orexin能神经投射,观察异氟醚麻醉下增强BF区Orexin能神经投射功能对全麻下意识状态及脑电特征的影响。研究方法(1)采用CRISPR/Cas9技术建立Hcrt-cre大鼠模型。分析Hcrt(Hypocretin)基因的结构,采用基于CRISPR/Cas9开发的EGE系统(Biocytogen Extreme Genome Editing System)制备模式大鼠。随后用PCR与Southern blot鉴定敲入基因的表达。(2)利用B-Tdtomato cKI rats自带荧光工具鼠和已经构建好的Hcrt-cre大鼠杂交,选取8周大鼠(n=3)灌流固定、取脑、后固定、脱水。脱水完毕后,用冰冻切片机连续切取包含Pef区脑片,厚度为35μm。随后进行免疫荧光染色:按照漂洗、封闭、孵育一抗、孵育二抗、DAPI染色、封片的顺序。计算荧光双标重合率(n=9)。(3)选用8周龄Hcrt-cre大鼠,单侧Pef(坐标)注射AAV-DIO-ChR2-mCherry病毒(n=3),病毒表达成功后,用冰冻切片机连续切取包含Pef区脑片,随后进行免疫荧光染色,贴片用共聚焦拍摄后计算荧光双标重合率(n=9)。(4)选用3周龄Hcrt-cre大鼠。双侧Pef区注射AAV-DIO-ChR2-mCherry病毒(n=4),病毒表达成功后制备含Pef区的下丘脑外侧区的活体脑片,孵育复苏后利用全细胞膜片钳技术,根据荧光表达钳制待观测细胞,记录不同参数蓝光激活后Orexin能神经元放电特征(n=5)。(5)选用8-10周龄雄性Hcrt-cre大鼠,随机分为两组(n=6);实验组与对照组分别单侧注射AAV-DIO-ChR2-mCherry和AAV-DIO-mCherry病毒于Pef区。在病毒注射位置向上0.1mm埋置用于光刺激的陶瓷插芯,并于颅骨表面埋置脑电电极用于脑电图(Electroencephalogram,EEG)记录。病毒表达四周后,通过光纤系统对Pef区进行蓝光(473nm)照射,同时测量翻正反射消失与恢复时间。(6)选用8-10周龄雄性Hcrt-cre大鼠,分组及方法同(5),采用PowerLab脑电监测系统进行全程脑电记录,两组均吸入1.4%异氟醚与纯氧1.5L/min,在异氟醚吸入40min后给予Pef区10min蓝光刺激(20Hz,10Mw,10ms)。并用Matlab软件分析光刺激前后脑电的爆发性抑制率(Burst suppression ratio,BSR)的变化。(7)选用8-10周龄雄性Hcrt-cre大鼠,随机分为两组(n=6);两组病毒注射同(5),在BF区埋置陶瓷插芯,并于颅骨表面埋置脑电电极。病毒表达四周后,对BF区进行蓝光(473nm)照射同时测量翻正反射消失与恢复时间。(8)选用8-10周龄雄性Hcrt-cre大鼠,分组及方法同(7);采用PowerLab脑电监测系统进行全程脑电记录,两组均吸入1.4%异氟醚与纯氧1.5L/min,在吸入异氟醚40min后给予对BF区进行蓝光(473nm)照射10min光刺激(20Hz,10Mw,10ms)。并用Matlab软件分析光刺激前后脑电的爆发性抑制率(BSR)的变化。(9)动物及分组同(7),病毒表达四周后,两组均吸入0.8%异氟醚与纯氧1.5L/min。在异氟醚吸入30min后给予10min光刺激(20Hz,10Mw,10ms)。采用PowerLab脑电监测系统进行全程脑电记录,并用Matlab软件分析光刺激前后脑电不同频段变化。同时用摄像头和录屏软件记录大鼠觉醒行为,之后进行评分。研究结果(1)Hcrt-cre转基因大鼠构建及Orexin能神经元标记特异性验证1)提取上述大鼠F0代与F1代鼠尾DNA进行PCR和Southern blot检测,结果表明用CRISPR/Cas9法构建的Hcrt-cre大鼠成功,制作的1EQ12-4,1EQ12-7和1EQ12-8均为阳性大鼠,1EQ12-4,1EQ12-7和1EQ12-8均为正确重组,且没有随机插入。2)子代Orexin自带荧光大鼠脑组织进行免疫荧光染色后,tdTomato和Orexin-A在下丘脑外侧区共标,有98.80±0.16%的Orexin-A阳性神经元表达tdTomato,而91.92±0.80%的tdTomato阳性神经元呈现Orexin-A阳性。(2)转染特异性光遗传激活病毒,离体验证光敏感通道蛋白ChR2在Pef区Orexin能神经元上的转染效率及功能,发现:1)注射ChR2-mCherry病毒后,免疫荧光染色,同样可发现在下丘脑外侧区有95.07±1.00%的Orexin-A阳性神经元表达mCherry,而91.92±0.80%的mCherry阳性神经元呈现Orexin-A阳性。2)钳制Orexin能神经元后,在电流钳模式下500ms持续光照时表现出强烈的去极化和放电,在电压钳模式下则表现为持续的内向电流,光刺激频率20Hz及以下时保真度可达100%。此结果提示光敏通道ChR2表达的神经元可被有效地激活,从电生理角度验证了光敏感通道在Hcrt-cre大鼠中的表达和功能。(3)利用光遗传学手段,在体条件下蓝光激活Pef区Orexin能神经元,观察兴奋Pef区Orexin能神经元对1.4%异氟醚麻醉下翻正反射消失和恢复时间(LORR&RORR)的影响,发现1.4%麻醉状态下,光刺激Orexin能神经元胞体能显著缩短翻正反射恢复时间,mCherry组恢复时间(923.3±72.42s)相比ChR2-mCherry组(493.3±30.62s)有显著缩短(P=0.0003),但诱导时间未见明显变化。光刺激Orexin神经元胞体也可减少脑电爆发性抑制率。(4)利用光遗传学手段,在体条件下蓝光激活Pef区Orexin能神经元向BF投射的神经末梢,观察兴奋Pef-BF环路Orexin能神经投射对1.4%和0.8%浓度异氟烷麻醉下翻正反射消失和恢复时间(LORR&RORR)的影响以及脑电频谱变化特征,发现:1)1.4%麻醉状态下,光刺激BF区的Orexin能神经元末梢显著缩短翻正反射恢复时间,mCherry组恢复时间(936.7±68.15s)相比ChR2-mCherry组(674.2±48.42s)有显著缩短(P=0.0105),同样诱导时间未见明显变化。BF区的Orexin能神经元末梢也可减少脑电爆发性抑制率。2)0.8%浅麻醉状态下,光刺激BF区Orexin能神经元终末可改变脑电频谱,δ功率显著降低(63.15±1.23%下降到42.14±3.47%,P=0.0002),θ功率(16.54±0.80%上升至22.34±1.87%,P=0.0172)和β功率显著增加(4.33±0.35%上升至10.98±1.79%,P=0.0045),同时可增加动物的觉醒行为学指标。研究结论在本研究中,我们采用CRISPR/Cas9技术成功构建了Hcrt-cre基因敲入大鼠,并利用PCR与Southern blot、免疫荧光双标等方法,验证了Hcrt-cre转基因大鼠构建效率及特异性。进而通过应用光遗传学特异性调控手段,分别探究了Pef区Orexin能神经元,以及Pef-BF神经环路中Orexin能神经投射对全麻的诱导,维持和觉醒过程中意识状态及脑电特征的影响,证实下丘脑Pef区向BF区的Orexin能神经投射促进全麻后意识向觉醒转化的作用。此外,我们构建的Hcrt-cre大鼠可作为Orexin能神经元研究的有效工具,为进一步研究Orexin能神经递质系统在大鼠体内的多种生理功能提供新的手段。