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第一章视紫红质T17M突变体的亚细胞定位目的：研究视紫红质T17M突变体的亚细胞定位及意义。方法：构建pCDNA-3.1-T17M rhodopsin-myc质粒和pCDNA-3.1-WT rhodopsin-myc质粒,使用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切法进行鉴定,基因测序。将构建成功的质粒转染到HEK293细胞,采用Western blot检测视紫红质T17M突变体和野生型的蛋白表达差异。免疫荧光显微镜下观察视紫红质T17M突变体和野生型的亚细胞定位。结果：经过PCR扩增和双酶切鉴定,获得约1000bp大小的条带,基因测序显示第50位碱基C突变成T,成功构建pCDNA-3.1-T17M rhodopsin-myc质粒和pCDNA-3.1-WT rhodopsin-myc质粒。质粒转染后,Western blot检测到约40KD的条带,转染可高效表达视紫红质T17M突变体和野生型蛋白。荧光显微镜检查发现,视紫红质T17突变体聚集在内质网,与高尔基体不存在共定位；而野生型主要位于细胞膜。结论：视紫红质T17M突变体异常定位于内质网,与高尔基体不存在共定位。视紫红质野生型主要位于细胞膜。第二章视紫红质T17M突变体的降解途径目的：研究视紫红质T17M突变体的降解途径及意义。方法：使用MTT法检测视紫红质T17M突变体和野生型的降解速度。Western blot检测溶酶体抑制剂CQ和蛋白酶体抑制剂MG132对视紫红质T17M突变体和野生型降解的影响。免疫沉淀检测视紫红质泛素化水平。Western blot检测p97/VCP-QQ(?)Erasin siRNA对视紫红质T17M突变体和野生型的半衰期的影响。结果：蛋白合成抑制剂CHX处理HEK293细胞和ARPE-19细胞6h后,CHX处理前视紫红质蛋白标化为1, HEK293细胞的视紫红质T17M突变体和野生型蛋白相对值分别为0.219±0.032和0.635±0.072(P<0.01), ARPE-19细胞的视紫红质T17M突变体和野生型蛋白相对值分别为0.302±0.041和0.531±0.052(P<0.01)。溶酶体抑制剂CQ处理HEK293细胞12h后,视紫红质T17M突变体由1增加到1.023±0.265,视紫红质野生型蛋白相对值由1增加到1.433±0.159(P<0.05)。蛋白酶体抑制剂MG132处L理HEK293细胞6h后,视紫红质T17M突变体由1增加到7.213±2.108(P<0.01),视紫红质野生型蛋白相对值由1增加到2.011±0.221(P<0.05)。免疫沉淀后,泛素化视紫红质T17M突变体由1增加到2.200±0.361(P<0.01),野生型蛋白相对值由1增加到1.160±0.162。在ARPE-19细胞中过表达p97/VCP-QQ后,对照组和p97/VCP-QQ组的视紫红质T17M突变体蛋白相对值分别为0.159±0.052和0.558±0.095(P<0.01)。Erasin siRNA处理后,视紫红质T17M突变体的对照组Erasin siRNA组的蛋白相对值分别为0.230±0.059和0.602±0.064(P<0.01),而视紫红质野生型降解速度没有明显变化。结论：与视紫红质野生型相比,T17M突变体降解加速。视紫红质T17M突变体只能通过蛋白酶体系统降解,而野生型可以通过自噬溶酶体系统和蛋白酶体系统降解。视紫红质T17M突变体的降解与泛素化的ERAD相关。过表达p97/VCP-QQ和Erasin siRNA干扰可以抑制视紫红质T17M突变体通过ERAD途径降解。第三章视紫红质T17M突变诱导细胞死亡的机制目的：研究视紫红质T17M突变诱导细胞死亡的机制。方法：建立pEGFP-CL1-ARPE-19细胞系,采用Western blot方法检测其蛋白酶体活性。过表达视紫红质蛋白,诱导内质网应激反应,采用Western blot方法检测内质网应激相关蛋白BIP、GRP94、CHOP、 peIF-2a、eIF-2a、active ATF-6a的表达差异,并用PBA处理细胞,观察PBA对以上内质网应激相关蛋白表达的影响。Tunicamycin处理ARPE-19细胞,流式细胞仪检测细胞死亡数目。过表达视紫红质T17M突变体,采用流式细胞仪检测细胞内ROS水平,并使用ROS清除剂NAC和BHA处理,观察细胞死亡变化情况。结果：pEGFP-CL1-ARPE-19细胞系可稳定表达uGFP,视紫红质T17M突变、野生型的uGFP表达量没有显著变化。T17M突变可使细胞内质网应激蛋白BIP、GRP94、CHOP、peIF-2a、eIF-2a、active ATF-6a表达上调,与视紫红质野生型相比,BIP、CHOP、GRP94、 peIF-2a/eIF-2a、active ATF-6a表达量分别增加2.439±0.363倍(P<0.01)、2.433±0.802倍(P<0.01)、1.600±0.212倍(P<0.05)、1.567±0.153(P<0.05)、2.167±0.306倍(P<0.01)。与视紫红质野生型相比,CHOP表达量在使用PBA处理前后分别增加了2.600±0.854倍和1.467±0.306倍(P<0.05),GRP94表达量处理前后增加1.921±0.557倍和1.203±0.239倍(P<0.05),peIF-2a/eIF-2a为1.733±0.154倍和1.167±0.252倍(P<0.05),active ATF-6a为2.564±0.406倍和1.349±0.529倍(P<0.05)。而使用内质网应激诱导剂‘Tunicamycin前后,空载体、视紫红质野生型和T17M突变体的ARPE-19细胞死亡率分别为4.156%±0.501%和4.814%±0.531%、3.879%±0.413%和5.712%±0.574%、7.021%±0.612%和16.213%±3.419%,视紫红质T17M突变体过表达的细胞死亡率较空载体和野生型明显增加(P<0.05)。与空载体组相比,视紫红质野生型和视紫红质T17M突变体ROS的相对比分别为1.136±0.055,1.935±0.088(P<0.01)。使用ROS清除剂NAC和BHA后,空载体组、DMSO组、NAC组和BHA组的死亡率分别为3.716%±0.523%、7.322%±1.924%、4.857%±1.369%(相比DMSO组,P<0.05)和4.271%±0.988%(相比DMSO组,P<0.01)。结论：视紫红质T17M突变不影响蛋白酶体活性。T17M突变能诱导细胞内质网应激,使内质网应激蛋白BIP、GRP94、CHOP、peIF-2a、 eIF-2a、active ATF-6a表达上调。化学分子伴侣PBA能缓解T17M诱导的内质网应激。视紫红质T17M突变增加细胞对内质网应激诱导剂Tunicamycin的敏感性。突变的T17M视紫红质增加细胞内ROS的水平,ROS清除剂NAC和BHA能抑制视紫红质T17M突变导致的细胞死