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大脑使我们具有了思考、学习的能力,承载了我们的智慧和情感,但是大脑的工作机制目前还不清楚。果蝇虽小,但十分“聪明”。其视觉功能强大,且神经回路复杂程度适中,具有丰富的遗传操作工具可供使用。因此,果蝇视觉是研究大脑功能的理想生物模型。大脑功能的研究离不开神经元功能信号记录技术,相对电生理,双光子钙成像技术可同时记录多个亚细胞结构的信号,在神经生物学领域被广泛应用。目前通常采用的果蝇活体钙成像方法实验步骤复杂耗时,或者不能保证果蝇足的自由活动。而研究表明果蝇活动状态对视觉神经元的功能信号具有显著影响。除了研究技术的不足,果蝇视觉回路功能也不完全清楚,如运动检测器神经元编码运动方向的模式以及其下游神经元的响应特性等。 针对现有问题,本文发展了一种简单高效的果蝇活体钙成像方法,进一步以视觉研究为模型验证了我们建立的果蝇活体钙成像方法的实用性,接着,对果蝇运动检测神经元编码斜向运动信息的模式进行了研究。 本文取得的主要研究结果和结论如下: (1)建立了简便、高效的果蝇活体钙成像方法。根据果蝇胸节背部隆起的形态特点,我们设计了特定的固定架,实现了不依赖辅助设备对果蝇的活体固定,并保证果蝇足可自由活动。此外,我们对胶水选择等实验细节也做了优化。最终简化了样品制备步骤和操作难度。把样品制备时间从40 min缩短到了5 min。接着,我们对可能影响钙成像效果的因素进行了分析并给出了解决方案,如图像抖动、激发光功率等。最终实现了用于果蝇的简便、高效的活体钙成像方法。 (2)建立了果蝇运动视觉钙成像研究模型。首先,我们设计了一种简单的视觉刺激器,由2个商品化模块组装而成,无需复杂电路设计。此外,我们使用橙色LED点阵制作刺激器显示屏,不需要滤光片即可把刺激器光源和钙染料两者的光谱分开。接着,以视觉研究为模型验证了我们建立的果蝇活体钙成像方法的实用性,并发现了小叶板切向细胞(LPTCs)新的响应特性:①VS神经元不仅响应垂直方向运动的视觉刺激,对水平方向运动视觉刺激也有显著钙响应,并且具有方向选择性(仅响应向后运动,对向前运动无响应)。这和 VS神经元树突的投射区域相一致。②VS和HS神经元对不同的斜向运动也具有选择性响应特性。VS神经元对后下方向运动的响应强度显著高于前下运动。HS神经元对后上方向运动的响应强度显著高于后下方向。③分别使用Rac1和GABA抑制剂调控VS神经元的兴奋性和抑制性输入,发现兴奋性和抑制性输入同时参与VS对运动方向信息的处理,该结果支持VS神经元通过调控兴奋性和抑制性输入来实现方向选择性响应的假说。 (3)用活体钙成像方法研究了果蝇运动检测器神经元编码斜向运动信息的模式。实验发现每个斜向运动在小叶板均有特定的激活区域。和四个基本方向运动的激活区域相比,斜向运动的激活区可分为两部分:选择性响应区和非选择性响应区。在选择性响应区里,运动检测器神经元T4和T5的轴突特异的响应一个斜向运动。而在非选择性响应区,T4和 T5神经元可以同时响应斜向运动和与之矢量相关的基本方向运动。这些结果说明,果蝇运动检测器神经元通过区域组合的模式编码斜向运动。