根癌土壤杆菌SCUEC1菌株中尼古丁降解基因agnB和agnE的克隆表达及agnE的功能分析

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尼古丁是烟草类植物体内主要的天然生物碱,对人体和环境有严重危害。采用传统的化学和物理方法处理耗时长,效率低,还会造成二次污染。利用微生物降解尼古丁效率高,环保。本实验室前期从湖北省襄阳市烟草种植地土壤中分离筛选了一株具有较高尼古丁降解能力的菌株,经鉴定为根癌土壤杆菌,命名为SCUEC1。本研究对根癌土壤杆菌SCUEC1菌株中尼古丁降解相关的两个基因agnB和agnE进行克隆表达,并对agnE基因功能进行分析。本论文的主要研究结果如下:(1)以根癌土壤杆菌SCUEC1菌株的总DNA为模板,通过PCR克隆获得agnB和agnE的基因片段,经测序可知agnB和agnE大小分别为1314bp和1029bp。利用在线软件对agnB和agnE编码的氨基酸序列进行预测和分析,预测agnB表达蛋白AgnB大小为48.8kDa,agnE表达蛋白AgnE大小为42.0kDa,AgnB和AgnE均为亲水性的非分泌性蛋白。(2)将agnB和agnE分别与质粒pET28a(+)连接,转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组质粒的转化菌株,提取质粒,并通过酶切和测序进行验证。采用不同的IPTG浓度、诱导温度以及诱导时间对重组质粒pET28a(+)-agnB和pET28a(+)-agnE进行诱导表达以获得最佳诱导表达条件,结果表明:重组质粒pET28a(+)-agnB和pET28a(+)-agnE均在诱导温度为30℃,诱导时间为20h条件下,表达量较高,在IPTG浓度为0.2-1.0mmol/L范围内,表达量均无明显差别。利用SDS-PAGE检测全菌液、上清和沉淀中的目的蛋白,检测结果表明,AgnB和AgnE大部分分布在沉淀中。利用不同浓度的咪唑洗脱液和镍柱对AgnE进行纯化和回收,发现使用250mmol/L咪唑洗脱液洗脱时得到较纯的AgnE。(3)根据实验室前期工作推测AgnE具有2,5-二羟基吡啶双加氧酶的功能。以2,5-二羟基吡啶为反应底物对AgnE进行功能分析,2,5-二羟基吡啶在320nm有特异吸收峰,酶促反应0、5、10和20min时反应液吸光度分别为0.6170、0.2273、0.0907、0.0667,320nm处的吸光度随反应时间增加而减少。表明AgnE具有2,5-二羟基吡啶双加氧酶活性。在pH8.0,温度20℃下,AgnE具有较高的2,5-二羟基吡啶双加氧酶活性。不同金属离子对AgnE生物活性的影响研究表明,Ni2+和Cu2+对AgnE生物活性有一定的抑制作用,而Ca2+和Fe2+对AgnE生物活性有一定的促进作用,Fe2+对AgnE生物活性的促进作用较高。(4)对AgnE的编码基因进行随机突变,获得三个AgnE突变体,分别为突变体AgnE33-46、突变体AgnE90-199、突变体AgnE260。突变体AgnE33-46中第33位谷氨酸突变为天冬氨酸,第46位谷氨酰胺突变为精氨酸;突变体AgnE90-199中第90位异亮氨酸突变为亮氨酸,第199位谷氨酰胺突变为脯氨酸;突变体AgnE260中第260位色氨酸突变为终止子。将未发生突变的AgnE生物活性设为100%,突变体AgnE33-46相对生物活性为12.60%,突变体AgnE260相对生物活性为4.50%。突变体AgnE90-199相对生物活性为110.30%。结果表明第33位谷氨酸或第46位谷氨酰胺为AgnE蛋白生物活性的必需氨基酸。
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