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金蝉花(Cordyceps cicadae)是麦角菌科真菌大蝉草寄生在山蝉幼虫上形成的复合物,性寒味甘,具有疏风散热之功效,是一种药食两用真菌,亦是我国传统名贵中药材之一。近代许多学者对金蝉花的药理活性进行了广泛研究,发现蝉花具有保护肾功能、延缓慢性肾功能衰竭的作用,还具有抗肿瘤、调节免疫功能等生物活性。金蝉花的活性成分主要包括多糖、核苷、虫草素、甘露醇、麦角甾醇等,现代药理研究表明,多糖作为其主要有效成分之一,具有明显的免疫调节、改善肾功能等作用,因此成为近年来研究和开发的热点。本论文通过本课题组前期已优化的提取条件,分别获得50%醇沉金蝉花多糖(CP50)和80%醇沉金蝉花多糖(CP80),采用体外抗氧化活性体系筛选出活性较高的粗多糖,利用DEAE-52纤维素离子交换柱和Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱等现代分离手段获得纯度均一的多糖组分,并对其结构特征以及免疫活性进行初步研究,为金蝉花多糖用于保健食品和医药产品的开发提供理论依据。主要研究内容如下:1.金蝉花多糖的抗氧化活性研究。采用热水浸提、不同浓度乙醇分级沉淀的方法从金蝉花中提取多糖,分别获得50%醇沉金蝉花多糖(CP50)和80%醇沉金蝉花多糖(CP80),并检测两者的体外抗氧化活性。结果表明,CP50和CP80均具有良好的抗氧化能力,且存在明显的量效关系。当多糖质量浓度达到0.8 mg/m L时,对DPPH自由基和?OH自由基的清除率CP50分别为79.16%、94.12%,CP80分别为58.73%、57.9%,表明CP50的抗氧化活性显著高于CP80,更适合开发为抗氧化剂。2.金蝉花多糖的分离纯化及理化性质研究。金蝉花多糖CP50经DEAE-52纤维素离子交换柱和Sphadex G-100葡聚糖凝胶柱分离纯化,得到CPA-1和CPB-1两个多糖组分。采用紫外全波长扫描和高效液相色谱法检测两者的纯度,结果表明,CPA-1和CPB-1都是纯度均一的多糖组分,两者的分子量分别为28.2kD和11.9kD。理化性质结果表明,CPA-1和CPB-1均为白色絮状固体;无味,均易溶于水,不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂;两者均不含淀粉、蛋白质和氨基酸。3.金蝉花多糖CPA-1和CPB-1的结构特征初步研究。运用GC、高碘酸氧化、Smith降解结合IR、CD、NMR等分析方法对金蝉花多糖组分CPA-1和CPB-1的单糖组成、糖链结构和多糖溶液构象进行解析。GC结果表明,CPA-1和CPB-1中均含有葡萄糖、甘露糖和半乳糖,其摩尔比分别为:1:0.479:0.615、1:0.14:0.114;硫酸咔唑法测得CPA-1和CPB-1的糖醛酸含量分别为0.956%和1.87%;采用苯酚-硫酸法测定CPA-1和CPB-1两个多糖组分的糖含量,得出CPA-1含糖量为82.3%,CPB-1含糖量为79.2%;红外扫描显示两个组分均具有多糖的典型特征吸收峰;1H NMR表明CPA-1和CPB-1主要由β构型糖苷键连接,同时也含有α构型糖苷键;高碘酸氧化和Smith降解分析初步推测,CPA-1中甘露糖、葡萄糖和半乳糖主要是以1→3位糖苷键连接的,此外可能还含有少量的1→2、1→4或1→6连接键型;CPB-1中葡萄糖主要由1→3键位连接,半乳糖和甘露糖主要是由1→2、1→4键位连接,还有少量的1→6连接键。CD结果表明外界条件的变化可影响CPA-1和CPB-1多糖分子的不对称性及其多糖溶液构象;刚果红实验发现,CPA-1和CPB-1均具有三股螺旋结构。4.金蝉花多糖的免疫活性初步研究。通过体外实验研究金蝉花多糖CPA-1和CPB-1对DC表型和功能的影响,为进一步阐明金蝉花多糖的免疫调节机制提供基础。实验分为阴性对照组(RPMI-1640培养基)和药物处理组,观察经金蝉花多糖组分CPA-1和CPB-1作用后树突状细胞的数量和形态变化,以及DC表面分子CD80/86、CD11c和MHC-Ⅱ类分子的表达情况。结果发现,在200μg/m L金蝉花多糖组分干预浓度范围内,DC数量和对照组的细胞数量无显著差异;但经金蝉花多糖作用后,DC表面伸出多个长短不一的毛刺样突起,这是DC成熟的特征;金蝉花多糖CPA-1和CPB-1干预组中,DC表面MHC-II类分子和共刺激分子(CD80/86、CD11c)的表达显著增加,说明金蝉花多糖CPA-1和CPB-1能够促进DC成熟,从而增强免疫调节功能。