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各种原因引起的视神经损伤性疾病在临床上较为常见,其中部分疾病会造成视神经进行性、不可逆性损伤,最终导致视力丧失。视神经细胞是一种终末分化细胞,再生能力差,导致损伤的视网膜神经难以修复再生,目前临床尚无有效方法治愈视神经疾病。近年来,应用干细胞治疗视网膜神经疾病这一方法极具前景,牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)由于其与视神经细胞同样来源于神经嵴,且较神经干细胞更易获得,而有望成为修复重建神经组织病损的种子细胞。目前研究认为,Notch及Wnt/β-catenin信号通路是脊椎动物视网膜神经发育所必需的。作为一种广泛表达于多个物种且在进化过程中高度保守的基因,Notch基因主要参与对细胞分化的抑制信号。Wnt/β-catenin信号的激活贯穿视网膜及视神经发育的整个过程,提示其在神经发育中起重要作用。分泌性卷曲蛋白2(secreted frizzled related protein 2,SFRP2)是一种Wnt信号通路抑制剂,同时也间接地参与了除Wnt信号以外的多个信号通路,如Notch及BMP信号通路等。SFRP2可与金属蛋白酶ADAM10结合,抑制Notch信号通路。已有研究表明SFRP2在神经形成过程中高表达,我们推测其可能通过抑制在干细胞增殖过程中发挥重要作用的Notch及Wnt信号通路,促进神经嵴来源的DPSCs向神经样细胞分化。为了验证上述假设,本课题借助多种细胞生物学和分子生物学手段,通过重组腺病毒载SFRP2基因体外转染人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,h DPSCs),同时利用h DPSCs同视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞共培养法诱导h DPSCs的神经向分化,明确SFRP2在h DPSCs向神经样细胞分化过程中的作用,初步探讨视神经修复再生机制及临床应用前景。方法:从完整拔除的健康第三磨牙内分离牙髓组织,酶消化复合组织块法原代培养h DPSCs。取第3代h DPSCs,MTT法绘制其生长曲线,并通过成脂及成骨诱导检测其多向分化潜能。通过流式细胞术和细胞毒性实验(MTT法)筛选合适的病毒感染复数(multiplicity of infection,MOI)。采用800 particles/cell的Ad-SFRP2转染h DPSCs,RT-PCR检测SFRP2的表达;并将转染Ad-SFRP2的h DPSCs与人RPE细胞共培养诱导其神经向分化,q PCR检测神经相关基因GFAP、Nestin、MAP2、HES1、β-3tublin及ATOH7的表达。结果:倒置显微镜下见体外培养的第3代h DPSCs贴壁生长,形态规则,呈长梭形,核圆,位于中央。甲苯胺蓝染色可见细胞成集落生长,分别进行成脂和成骨诱导,35天油红O染色及21天茜素红染色可见脂滴及钙结节。生长曲线显示第4天细胞由滞留期进入对数生长期,第9天细胞进入平台期。转染Ad-EGFP的h DPSCs在转染后8 h镜下即可见绿色荧光蛋白的表达,转染Ad-SFRP2的h DPSCs在转染后72 h提取总m RNA,RT-PCR检测到SFRP2基因的表达。共培养及Ad-SFRP2转染结果表明,GFAP的表达早期表现为共培养诱导组高于转染组,晚期则表现转染组稍高表达;Nestin早期在共培养诱导组及转染组中表现为一定的上调趋势,晚期表达则呈下调趋势;β-3tublin的表达在共培养诱导组及转染组中呈持续性下调;MAP2在共培养诱导组晚期呈现较高表达;HES1在共培养诱导组早期呈现较高表达,晚期则表达降低,在转染组较非转染组呈下降趋势;ATOH7的表达在各组均无统计学意义。结论:SFRP2可以促进牙髓干细胞的神经向分化,但具体机制有待于进一步实验阐明。