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研究目的：第一部分,成功构建2型糖尿病大鼠模型,检测糖尿病骨性关节炎对大鼠经典Wnt/β-catenin通路中分子Wnt1、Wnt10b、β-catenin及其下游CyclinD1、MMP-7、MMP-2和MMP-9表达水平的影响.初步探讨糖尿病性关节炎可能的发生机制,为糖尿病性关节炎的研究提供动物实验依据.第二部分,在第一部分动物实验研究的基础上,从细胞水平进一步探讨经典Wnt/β-catenin信号转导通路中分子Wnt1、Wnt10b、β-catenin及其下游CyclinD1、MMP-7、MMP-2和MMP-9表达的变化以及其在糖尿病性关节炎发生发展中的可能作用机制.为证实经典Wnt/β-catenin信号转导通路在糖尿病性关节炎中的作用机制提供细胞学实验依据.第三部分,在前两部分研究的基础上,通过调控Wnt/β-catenin信号通路激动剂LiCl及Wnt信号通路抑制因子DKK-1对高糖作用的人滑膜细胞进行调控,观察调控Wnt/β-catenin通路对人滑膜细胞增殖及凋亡以及Wnt1,Wnt10b及β-catenin和滑膜细胞上清液中CyclinD1、MMP-7、MMP-2和MMP-9表达水平的影响. 研究方法：第一部分,选取体重180-200g的成年SD大鼠共98只,分为四个组别.第一组,按随机数字表法随机抽取20只SD大鼠不做任何处理,作为对照组;第二组,按随机数字表法随机抽取25只SD大鼠通过高脂饮食联合腹腔注射链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)的方法构建大鼠2型糖尿病模型(剂量水平：每kg代谢体重注射约30mgSTZ),共造模成功22只大鼠作为糖尿病组;第三组按随机数字表法随机抽取25只SD大鼠,通过第1、3、7天注射4%木瓜蛋白酶溶液与0.03mol/L L-半胱氨酸溶液混合液20μl至大鼠膝关节腔内,建立骨性关节炎SD大鼠模型作为骨性关节炎组,共成功造模20只大鼠.第四组,剩余28只SD大鼠采用以上第二组,第三组同样的方式(糖尿病组+骨性关节炎组的方式)建立联合干预组,共成功造模21只大鼠.以上各组造模成功后3周,采用ELISA法检测各组大鼠膝关节腔冲洗液中CyclinD1、MMP-7、MMP-2和MMP-9的表达水平.采用RT-PCR、Western blotting等方法检测各组大鼠膝关节经典的Wnt/β-catenin信号转导通路分子Wnt1,Wnt10b及β-catenin的基因以及蛋白表达变化,采用HE染色观察各组大鼠膝关节病理学变化情况.第二部分,建立人滑膜细胞的体外细胞培养模型.体外,以不同浓度高糖(分别为20mmol/L,30mmol/L,40mmol/L高糖浓度)培养基干预人滑膜细胞,采用MTT比色法测定各组滑膜细胞的存活率.取对数生长期的人滑膜细胞,调整其密度为6×108/L.对照组人滑膜细胞在1640培养基(葡萄糖浓度11mmol/L)中进行培养,实验组的人滑膜细胞分别在20mmol/L,30mmol/L,40mmol/L的3个高糖浓度培养基中培养(即分为3个亚组),甘露醇组人滑膜细胞在1640培养基(葡萄糖浓度11mmol/L)+甘露醇19.5mmol/L中培养,作为渗透压对照组.各组滑膜细胞分别培养24-96h不同时间点,采用MTT法检测各组人滑膜细胞的细胞活性变化情况,通过流式细胞术的方法检测以上各组人滑膜细胞周期及凋亡情况的变化.通过RT-PCR和Western blotting等方法检测以上各组人滑膜细胞Wnt1,Wnt10b及β-catenin的基因及蛋白表达水平;采用ELISA法检测以上各组人滑膜细胞上清液中CyclinD1、MMP-7、MMP-2和MMP-9的表达水平.第三部分,同第二部分建立人滑膜细胞体外培养模型,模拟糖尿病性关节炎时滑膜细胞所处高糖环境,人高糖滑膜细胞的体外细胞模型在40mmol/L的高糖浓度培养基中培养.根据处理不同分为三组：对照组(40mmol/L的高糖浓度培养基中继续培养)不予任何处理;DKK-1组(40mmol/L的高糖浓度培养基中培养的同时,予以100ng/mL DKK-1处理);LiCl组(40mmol/L的高糖浓度培养基中培养的同时,予以20mmol/L LiCl处理);三组细胞分别培养24-96h不同时间点,采用MTT法检测三组细胞的细胞活性情况,通过流式细胞术的方法检测以上三组人滑膜细胞周期及凋亡情况的变化.通过RT-PCR和Western blotting等方法检测以上三组人滑膜细胞Wnt1,Wnt10b及β-catenin基因和蛋白的表达水平;采用ELISA法检测以上三组人滑膜细胞上清液中CyclinD1、MMP-7、MMP-2和MMP-9表达水平的变化.最后,应用生物统计学软件SPSS16.0进行数据统计分析;本实验所有数据资料的组间比较采用单因素方差(One-way ANOVA)程序分析,本研究的实验结果以平均数(x)±s标准差表示,并规定P<0.05为差异具有显著性. 研究结果：第一部分,与对照组相比,3组实验组Wnt1,Wnt10b及β-catenin基因和蛋白表达水平均显著升高(P<0.05),联合干预组以上指标升高更显著(P<0.01);3组实验组大鼠膝关液中CyclinD1、MMP-7、MMP-2和MMP-9表达水平明显升高(P<0.05),联合干预组以上指标升高更显著(P<0.01);HE染色显示,骨性关节炎组和联合干预组均出现关节软骨变薄且有裂隙形成、纤维变性、基质分解破坏等退行性改变,联合干预组的以上病理变化更为明显.第二部分,高糖在体外对人滑膜细胞生长具有明显的促进增殖作用和减少凋亡作用,对人滑膜细胞周期影响则不明显.人滑膜细胞经体外20-40mmol/L高糖培养基培养24-96h后,其促进滑膜细胞增殖作用呈浓度依赖性和时间依赖性,随着高糖浓度的增加和干预时间的延长,滑膜细胞凋亡抑制率逐渐升高.在RT-PCR和Western blotting等实验中,与对照组及甘露醇组相比,Wnt1,Wnt10b及β-catenin基因和蛋白表达水平均显著升高(P<0.05),且亦呈浓度依赖性和时间依赖性.在ELISA实验中,滑膜细胞培养基上清液中CyclinD1、MMP-7、MMP-2和MMP-9表达水平亦显著升高(P<0.05).第三部分,与对照组相比,RT-PCR和WB实验中,Wnt信号通路抑制因子DKK-1组24-96h,Wnt1,Wnt10b及β-catenin基因和蛋白的表达水平明显降低(P<0.05),人滑膜细胞增殖生长具有明显的生长抑制作用,促进滑膜细胞凋亡,对细胞周期影响不明显,培养基上清液中CyclinD1、MMP-7、MMP-2和MMP-9表达明显降低(P<0.05);与对照组相比,RT-PCR和Western blotting等实验中,Wnt/β-catenin信号通路激动剂LiCl组观察24-96h,Wnt1,Wnt10b及β-catenin基因和蛋白的表达水平明显升高(P<0.05),对人滑膜细胞增殖生长具有明显的生长促进作用,抑制滑膜细胞凋亡,对滑膜细胞周期影响不明显.人滑膜细胞培养基上清液中CyclinD1、MMP-7、MMP-2和MMP-9的表达水平明显升高(P<0.05).随着滑膜细胞培养时间的延长,细胞中的Wnt1,Wnt10b及β-catenin基因、蛋白以及培养基上清液中CyclinD1、MMP-7、MMP-2和MMP-9表达水平明显增加,呈明显的时间依赖性.所有实验组中人滑膜细胞的存活率均随着培养时间的延长而增加,呈明显的时间依赖性,与对照组相比,LiCl干预显著提高了人滑膜细胞的存活率(P<0.05),而DKK-1组中人滑膜细胞的存活率则显著下降(P<0.05).所有实验组中人滑膜细胞的凋亡率随着培养时间的延长而降低,亦具时间依赖性,与对照组相比,LiCl干预显著降低了人滑膜细胞的凋亡率(P<0.05),而DKK-1组中人滑膜细胞的凋亡率显著提高(P<0.05). 研究结论：1、2型糖尿病高糖内环境可能通过上调Wnt1,Wnt10b表达继而激活经典的Wnt/β-catenin信号转导通路发挥作用,高糖内环境能促进骨性关节炎大鼠膝关节液中CyclinD1、MMP-7、MMP-2和MMP-9的表达,并加重骨性关节炎大鼠膝关节病理损伤.但是其具体作用机制,仍需要进一步的细胞实验证实.2、体外研究证实,高糖可以促进人滑膜细胞增殖生长,抑制滑膜细胞凋亡,对滑膜细胞周期无显著影响,其促进滑膜细胞增殖作用及促进表达作用呈浓度依赖性和时间依赖性,以上作用可能通过上调Wnt1,Wnt10b表达继而激活经典的Wnt/β-catenin信号转导通路引起的;高糖也能促进人滑膜细胞培养基上清液中CyclinD1、MMP-7、MMP-2和MMP-9表达.3、DKK-1阻断Wnt/β-catenin通路后,高糖对人滑膜细胞促进增殖、抑制凋亡,促进Wnt1,Wnt10b及β-catenin基因、蛋白表达和促进人滑膜细胞培养基上清液中CyclinD1、MMP-7、MMP-2和MMP-9表达的作用受到了抑制;LiCl激动Wnt/β-catenin通路后高糖对人滑膜细胞促进增殖、抑制凋亡及促进Wnt1,Wnt10b及β-catenin基因、蛋白表达和促进培养基上清液中CyclinD1、MMP-7、MMP-2和MMP-9表达的作用更加显著.