甲型流感病毒(influenza A virus,IFAV)是婴幼儿和免疫力低下成年人下呼吸道感染的主要病原体之一,年幼患者可诱发咳嗽喘息,症状严重的患儿甚至导致死亡。高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza virus,hPAIV)属于IFAV。由于流感病毒极其容易变异,迄今为止,对IFAV感染尚缺乏有效的抗病毒治疗药物。脱氧核酶(DNAzyme,DZ)是一种具有催化活性的短单链DNA分子。能够抑制细胞内RNA表达。它是通过对体外合成的随机序列库进行筛选得到的具有RNA切割功能的DNA分子。理论上,DZ能够对任意序列的RNA分子进行特异性切割。本研究的目的是设计合成作用于IFAV的特异性DZ并验证其抗病毒活性。第一部分:抗IFAV广谱脱氧核酶靶点的选择、设计、修饰与合成目的:设计、修饰和合成特异性广谱针对甲型流感病毒的脱氧核酶,为后续研究奠定基础。方法:靶RNA中DZ切割位点的选择主要考虑三个因素。第一,该位点对病毒复制至关重要。即阻断后可以明显甚至完全抑制病毒复制。第二,靶序列在不同的IFAV株间高度保守。克服流感病毒变异引起的耐药。第三,通过对RNA二级结构的计算机辅助分析,靶位点应容易接近,且在一个不稳定的位置以利于DZ的切割作用,避免与人类基因组有同源性,以避免可能的非特异性副作用。结果:根据上述靶位点选择的原则,选择在IFAV转录复制中起重要作用的M2、PB1等2个基因作为脱氧核酶干扰的靶点,设计和合成了针对IFAV的2种脱氧核酶DZ-M2,DZ-PB1,为利用脱氧核酶抑制IFAV复制奠定基础。作为对照,我们设计了相同底物的19nt的反义寡苷酸(ASODN-M2、ASODN-PB1)和2个在15nt催化域有一个点突变的突变体DZ(mutDZ-M2、mutDZ-PB1)。其对照反义寡核苷酸ASODN,即侧臂与DZ完全相同而没有中间的15nt酶切环。为了提高DZ和ASODN的稳定性,在化学合成过程中我们对5’端和3’端的3个核苷酸进行了硫代修饰。此外,在细胞培养模型中,我们应用了脂质体转染的方法以提高细胞对脱氧核酶的摄取。结论:成功设计和合成2种特异性针对甲型流感病毒的脱氧核酶DZ-M2与DZ-PB1,并设计和合成作为对照的反义寡核苷酸及突变体DZ,为利用脱氧核酶抑制IFAV复制奠定基础。序列如下。第二部分:体外切割底物RNA的制备目的:制备切割底物RNA,为体外无细胞体系切割实验作好准备。方法:通过RT-PCR方法获得目的基因M2、PB1cDNA,将PCR扩增片段定向克隆到pBluescript KSII+嗜菌粒T7启动子的下游,SpeI与HindIII内切酶位点之间,获得重组嗜菌粒PBKS-M2、PBKS-PB1。经HindIII和SpeI双酶切反应、菌落PCR、以及DNA测序鉴定重组质粒。重组质粒PBKS-M2、PBKS-PB1经HindlII线性化后作为体外转录反应的模板。体外转录反应用T7 MAXIscipt体外转录试剂盒(Ambion公司,美国)进行,经体外转录获得M2基因、PB1基因的单链RNA片段,作为体外DZ切割反应的底物。结果:按上述方法成功构建2个重组嗜菌粒PBKS-M2、PBKS-PB1,经过双酶切鉴定、PCR鉴定及测序鉴定为正确重组质粒,并通过体外转录获得相应单链底物RNA。结论:成功构建2个重组嗜菌粒PBKS-M2、PBKS-PB1并通过体外转录获得相应单链底物RNA。第三部分:脱氧核酶在无细胞体系对IFAV RNA的剪切活性及脂质体转染效率和对细胞毒性的观察目的:研究DZ-M2、DZ-PB1在无细胞体系剪切靶RNA的活性,对催化反应的时效性进行评价。方法:利用体外转录获得的M2、PB1-mRNA及合成并进行硫代修饰的DZ-M2、DZ-PB1进行DZ的细胞外切割实验,并将ASODN-M2、ASODN-PB1、mutDZ-M2和mutDZ-PB1作为细胞外切割实验的对照。切割体系:MgCl2( 100mM) 1μl,Tris.Cl(250 mM,PH=7.55)2μl,转录产物1μl (1pmol),DZ1μl(1pmol),0.1%DEPC水补足至10μl。充分混合上述混合物,37℃孵育,在不同的时间点分别加入0.5M EDTA1μl(60分钟、90分钟、120分钟、240分钟和240分钟)终止反应。70℃变性15分钟后置于冰上。含7M尿素的8%变性聚丙烯酰氨凝胶电泳,银染法观察结果。凝胶成像系统观察、保存、图像,分析电泳条带密度。流式细胞仪检测脂质体转染效率,MTT法检测脂质体转染脱氧核酶的MDCK细胞存活率。结果:DZ-M2、DZ-PB1在既定的位点将底物RNA切割,随着反应时间的延长,其切割效率逐渐增加,呈时间依赖性增强。mutDZ和ASODN无剪切活性。脂质体转染脱氧核酶获得良好的转染效率,而脂质体转染脱氧核酶无明显细胞毒性。结论:在无细胞系统中,DZ-M2、DZ-PB1能高效切割IFAVM2、PB1 m RNA,切割反应具有高度的序列特异性和时间依赖性。mutDZ和ASODN无剪切活性。第四部分:脱氧核酶培养细胞内抑制甲型流感病毒复制的效应观察目的:观察细胞培养体系脱氧核酶对甲型流感病毒的抑制作用并验证其相应的对照寡苷酸的抗IFAV的活性。方法:倒置相差显微镜下观察DZ对IFAV引起的细胞病变的抑制作用:;MTT定量比色法观察DZ的毒性及对细胞CPE形成的影响;空斑形成实验检测DZ对病毒滴度的影响; RT PCR检测DZ对IFAV mRNA表达的影响;Westernblot和间接免疫荧光方法检测DZ对IFAV蛋白表达的影响。结果:DZ-M2、DZ-PB1在低浓度下(0.3μM)经过脂质体转染能够抑制IFAV引起的MDCK细胞的特异性CPE,并且呈剂量依赖性,ASODN-M2、ASODN-PB1仅仅对CPE显示出轻微的抑制作用。DZ-M2和DZ-PB1能够特异性地降低病毒产量,对感染细胞具有保护作用,能够特异性降低IFAV-M2或PB1 mRNA的表达和M2蛋白表达。说明M2与PB1在甲型流感病毒的转录和复制中起关键的作用。DZ较ASODN具有更高的抑制IFAV的作用。结论: DZ -M2、DZ-PB1对IFAV在细胞感染模型中具有广谱、高效的抗病毒活性,可望成为有效的抗IFAV治疗药物。并为高致病性禽流感的治疗和控制提出新的思路和方法。