宫内生长受限(intrauterine growth restriction,IUGR)或胎儿生长受限(fetal growth restriction,FGR)指的是胎儿生长速率低于正常胎儿生长潜力的一种病理状态。目前尚无统一的诊断标准,临床上通常以小于胎龄儿(smallforgestationalage infants,SGA)的定义,即“出生体重低于同胎龄同性别胎儿的平均出生体重的第十百分位数或两个标准差”作为诊断依据。IUGR是死产的主要危险因素,显著增加围产期的发病率和死亡率。大量的流行病学证据已证实,IUGR与成年期心血管疾病(cardiovasculardiseases,CVDs)的风险增加密切相关;已有研究表明,IUGR个体成年期CVDs风险的增加与生命早期血管功能和结构的改变有关,主要表现为血压升高、血管舒张功能受损以及主动脉内膜增厚等。我们课题组前期研究发现,IUGR大鼠在成年期经历低氧后发生肺动脉高压、肺血管重构的风险显著增加,与肺血管内皮功能改变有关。鉴于血管内皮在维持血管张力和结构中的重要作用,上述的血压升高、血管重塑以及血管舒张功能受损实际上反映了血管内皮功能失调。然而,这种与IUGR有关的血管内皮功能失调的具体分子机制尚不清楚。血管内皮功能失调以内皮依赖的血管舒张功能受损为特征,与许多心血管疾病的发生发展密切相关。一氧化氮(nitric oxide,NO)生物利用度降低是血管内皮功能失调的关键。NO是一种血管舒张因子,主要由内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)通过 L-精氨酸(L-arginine)/NO 通路所合成,对维持血管张力和内稳态具有重要作用。L-arginine/NO通路还受到精氨酸酶(arginase)的调控,L-arginine可以被arginase转化为鸟氨酸(ornithine)和尿素(urea),过多的arginase通过竞争底物L-arginine导致eNOS解聚、NO合成减少,引起血管功能失调。此外,非对称性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine,ADMA)是一种内源性的NOS抑制剂,通过影响NO的生成引起血管功能失调。血循环中的ADMA可作为评估心血管风险的标志物。内源性的ADMA是由蛋白精氨酸甲基转移酶(proteinargininemethyltransferase,PRMT)催化合成的,主要通过二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶(dimethylarginine dimethylaminohydrolase,DDAH)进行代谢。内皮素-1(endothelin-1,ET-1)是一种强效的血管收缩因子。血管内皮产生的ET-1作用于平滑肌细胞的内皮素A型受体(endothelin receptor type-A,ETAR)和 B 型受体(endothelinreceptortype-B,ETBR)从而引起血管收缩;而ET-1与内皮细胞上分布的ETBR结合,则可促进NO的释放和ET-1的清除,进而调节血管舒缩。血管内皮ET-1基因的表达受到转录因子缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1 α,HIF-1α)的调控。我们前期研究发现,在 IUGR 新生大鼠的肺血管内皮细胞中,HIF-1α在ET-1基因启动子区富集,导致ET-1表达增加,与成年期肺血管对低氧的敏感性升高密切相关。越来越多的研究表明,L-arginine/NO通路在IUGR相关的血管功能失调中具有重要作用,然而arginase、ADMA和ET-1通路是否参与了 IUGR的血管内皮功能的调控有待进一步的研究。基于以上论述,我们提出假设:(1)IUGR影响血管内皮功能相关的基因表达,从而引起血管功能失调;(2)arginase、ADMA和ET-1通路参与了 IUGR相关的血管内皮功能失调。本研究通过收集IUGR和正常新生儿的脐带组织,分离培养脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),评估其增殖能力,分析与血管张力调节、氧化应激以及血管生成相关基因的转录情况,从而研究IUGR对血管内皮功能的影响;通过分析血管内皮NO的生成、ADMA代谢、arginase的活性和表达,以及ET-1系统的表达情况,研究arginase、ADMA和ET-1通路在IUGR的血管内皮功能调控中的作用,从而进一步探究IUGR相关的血管内皮功能失调的潜在分子机制。第一部分宫内生长受限对人脐静脉内皮细胞功能的影响目的:1.了解宫内生长受限(IUGR)新生儿及产妇的临床特征。2.通过分离培养原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs),建立IUGR组和Control组的血管内皮细胞系。3.通过评估HUVECs的增殖能力,分析血管功能相关基因的转录水平,研究IUGR对血管内皮功能的影响。方法:1.临床资料的收集:从三家医院产科收集新生儿及产妇的病历资料。排除多胎、先天畸形、感染、孕期用药等,根据胎儿生长曲线,以出生体重在第十百分位数以下的新生儿为IUGR组;以出生体重在第十百分位数至第九十百分位数之间的新生儿为对照(Control)组。整理分析收集的新生儿及产妇的临床资料。2.原代HUVECs的分离培养及鉴定:用胶原酶消化法从新鲜脐带组织中分离培养原代脐静脉内皮细胞,用免疫荧光法进行鉴定,传代培养。3.细胞增殖能力的评估:用CCK-8法检测HUVECs的增殖情况。4.分析血管功能相关基因的表达谱:实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测并分析与调节血管张力、氧化应激、血管生成的基因的转录水平。结果:1.共纳入IUGR组和对照组各15例。新生儿及产妇的临床特征显示:IUGR组新生儿的出生体重(P=0.002)和体重指数(P= 0.002)显著低于对照组。IUGR组新生儿的出生体重均在第5百分位数以下,中位数位于第3百分位数。与对照组相比,IUGR组更容易出现胎儿状态不良或胎儿窘迫(P=0.025)。2.分离培养的原代细胞于显微镜下表现为典型的血管内皮细胞外观:呈多角形或梭形,大小均匀,核大且清晰,胞浆丰富,细胞汇合时呈紧密排列的单层鹅卵石镶嵌状。3.免疫荧光鉴定结果显示:内皮特异性抗原血小板内皮黏附分子1(CD31)和血管假性血友病因子(vWF)阳性的细胞均占95%以上。4.CCK-8细胞增殖曲线显示:IUGR组的HUVECs在培养96h时检测的增殖速率显著高于对照组(P= 0.003)。5.RT-qPCR结果显示,IUGR的HUVECs中促进血管收缩的EDN1(P = 0.018)、ARG2(P = 0.007)基因表达增加,调节血管舒张的NOS3(P = 0.035)、EDNRB(P = 0.023)、AGTR1(P<0.001)基因表达减少;参与氧化应激的HIF1A(P= 0.008)基因上调,抗氧化的SOD1(P=0.005)基因下调;促血管生成的ANG(P<0.001)基因上调,抗血管生成的AKAP12(P<0.001)基因下调。结论:1.成功构建IUGR组和Control组的血管内皮细胞系。2.IUGR促进血管内皮细胞增殖。3.IUGR的血管内皮细胞中调节血管收缩和舒张、氧化应激和抗氧化、血管生成和抗血管生成的基因表达失衡,提示血管内皮功能失调。第二部分宫内生长受限相关的血管内皮功能失调的机制研究目的:1.验证血管内皮细胞中NO生物利用度降低,以及eNOS和Arg-2的表达失衡在IUGR相关的血管内皮功能失调中的重要作用。2.研究血管内皮细胞中内源性NOS抑制剂ADMA,以及ADMA合成与分解代谢所需的酶PRMT和DDAH是否参与了 IUGR相关的血管内皮功能失调。3.探究血管内皮细胞中调控血管收缩的ET-1和ETBR,以及转录因子HIF-1α在IUGR相关的血管内皮功能失调中的作用。方法:1.通过Griess比色分析法检测HUVECs中NO的代谢物亚硝酸盐和硝酸盐总量,以测定NO的生成量。2.通过Arginase活性试剂盒检测arginase的活性。3.用100μM的氯化钴(CoCl2)对HUVECs处理24h,以模拟低氧条件。4.用酶联免疫分析(ELISA)法测定HUVECs中L-arginine和ADMA的水平。5.通过免疫荧光法分析HUVECs中的ET-1、ETBR的空间定位情况。6.通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和免疫印迹(western blot)检测HUVECs中 eNOS、arginase-2、PRMT1、DDAH1、DDAH2、ET-1、ETBR 和 HIF-1α 的表达水平。结果:1.与对照组相比,IUGR组HUVECs中NO生成减少(P = 0.002),同时eNOS表达减少(P=0.021),而精氨酸酶活性(P = 0.012)和Arg-2表达(P= 0.009)水平均升高。2.与对照组相比,IUGR组的HUVECs内ADMA水平(P=0.001)和ADMA/L-arginine比值(P=0.046)均升高,同时DDAH1蛋白表达显著减少(P = 0.010)。3.在低氧条件下,对照组HUVECs中ADMA水平较正常氧浓度时升高(P=0.042);与对照组相比,IUGR组ADMA/L-arginine比值明显升高(P=0.003),同时PRMT1表达显著增加(P=0.006)。4.HUVECs中的ET-1和ETBR的空间分布具有相关性。IUGR组ET-1(P= 0.004)和HIF-1α(P=0.007)表达增加,而ETBR的表达减少(P= 0.027)。在低氧条件下,IUGR组HIF-1α表达水平仍高于对照组(P= 0.027)。结论:1.IUGR的血管内皮细胞中eNOS和Arg-2表达失衡,导致NO合成减少、生物利用度降低,引起血管功能失调。2.IUGR的血管内皮细胞中DDAH1表达减少,ADMA分解代谢减少,导致ADMA积聚,NO合成减少,引起血管功能失调。3.在低氧条件下,IUGR的血管内皮细胞中PRMT1表达增加,ADMA合成代谢增加,导致L-arginine生物学利用度降低,从而引起血管功能失调。4.IUGR的血管内皮细胞中HIF-1α表达增加,促进ET-1的转录,同时ETBR表达减少,导致NO释放减少,引起血管功能失调。