论文部分内容阅读
铁载体(Siderophore)是由大多数微生物产生的一类低分子质量,对Fe3+具有高度亲和力的铁的螯合物。根据我们对近10年的文献调查发现针对真核微生物Siderophore的研究只占了较少部分,而针对陆生碱性环境微生物Siderophore的研究目前尚无相关报道。因而,本课题组针对陆生碱性环境真菌Siderophore进行了初步的研究。本文基于CAS筛选原理对分离于云南省碱性湖泊-程海和个旧大屯碱性尾矿土壤的99株真菌进行不同层次筛选。在初筛阶段,共筛选出36株具有铁载体活性的真菌菌株;通过进一步复筛,确定了4株铁载体活性最强的真菌菌株,分别是菌株"FEDT-866"、"FEDT-145"、"FECH-998"和"FECH-595"。之后,进一步利用"CAS双层平板法”、"TLC-CAS原位显色法”及“分光光度法”对其产铁载体能力进行了验证;考察了这4株真菌液体发酵过程中树脂原位吸附活性产物效果、并且对涉及菌株进行了分子生物学初步鉴定。经鉴定,菌株FEDT-866属于曲霉属微生物,与塔宾曲霉Aspergillus tubigensis相似性较高;菌株FECH-998属于曲霉属微生物,与集峰曲霉Aspergillus nomius相似性较高;菌株FECH-595属于青霉属微生物,与Penicillium svalbardense相似性较高;菌株FEDT-145属于青霉属微生物,与产黄青霉Penicillium chrysogenum相似性较高。在化合物分离阶段,菌株FECH-998、菌株FECH-595和菌株FEDT-145各采用无铁查氏培养基发酵20L;菌株FEDT-866则采用无铁查氏培养基发酵1L。得到发酵液粗提取物或滤液后,采用正相硅胶柱层析、CHP20P吸附、Sephadex-LH20凝胶柱层析、结晶、重结晶、HPLC检测与HPLC制备等分离手段进行分离纯化,共分离得到了30个化合物,鉴定了14个,其中8个为新化合物。从菌株FEDT-866发酵液滤液中分离得到了2个馏分FS-01和FS-02,这2个馏分都具有很强的铁载体活性,其化学结构还在进一步解析当中。从菌株FECH-998发酵液粗提物中分离得到1个具有高铁载体活性的化合物-FS-03,经化合物结构解析,鉴定为曲酸(kojic acid)。从菌株FECH-595发酵液粗提物中分离得到13个化合物,经化合物结构解析,鉴定了6个化合物结构,分别为:化合物FS-07(4-(2-hydroxyethyl)phenol);化合物FS-08(O-methyl (dihydroxyacetyl)prop-l-en-2-ylcarbamothioate);化合物FS-10(4-methyl-8-azabicyclo[3.2.1]oct-5(8)-ene-2,6-dione);化合物FS-12(methyl (2-acetyl-3,-dihydroxy-4-methoxyphenyl)acetate);化合物FS-13(3-(3-hydroxypropyl)furan-2(5H)-one)及化合物FS-15(2,3,4-trimethyl-3-[(1E)-3-oxobut-l-en-1-yl]cyclohexanone)。其中, FS-08、FS-10、FS-12及FS-13均为新结构化合物,并且FS-08和FS-12具有微弱CAS活性。从菌株FEDT-145发酵液粗提物中分离得到14个化合物,经化合物结构解析,鉴定了7个化合物结构,分别为:化合物FS-04(Uridine);化合物FS-05(11S,14S-cyclo-L-Trp-L-Phe);化合物FS-06(WIN64821);化合物FS-09(7-methoxy-2-benzofuran-1(3H)-one);化合物FS-11(6-methyl-2-oxopyridine-1(2H)-carboxamide);化合物FS-14(5-hydroxymethyl-1H-1,3-diazepine-4,7-dione)及化合物FS-16(3-benzyl-6-[hydroxy(2-hydroxyphenyl)methyl]piperazine-2,5-dione)。其中,化合物FS-09、化合物FS-11、化合物FS-14及化合物FS-16均为新结构化合物,并且化合物FS-14具有强CAS活性,化合物FS-11和FS-16具有微弱CAS活性。该工作为进一步开展该环境下真菌铁载体类次生代谢产物研究奠定了基础。