表观遗传是指DNA序列不发生变化,但基因表达却发生了可遗传的改变。真核生物中,表观遗传通过调控染色质构象进而影响基因表达来控制植物的发育,其调控机制主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和小干扰RNA。近年来,表观遗传在植物发育和环境互作中的调控作用被广泛研究,但在柑橘上的研究尚少。为了揭示表观遗传在柑橘生长发育中的调控作用,本课题研究了DNA甲基化在柑橘果实发育过程和愈伤类胡萝卜素代谢的调控作用,并对柑橘基因组中组蛋白修饰酶基因进行了鉴定和分析。另外,本研究还以柑橘胚珠为材料,利用表观组的研究方法解析了柑橘多胚发育过程中的表观变化。主要研究结果如下:1.果实发育过程中DNA甲基化的变化通过毛细管电泳测定6个果实发育时期的DNA甲基化水平,发现DNA甲基化修饰随着果实发育和成熟是动态变化的。进一步克隆了DNA甲基化控制基因,包括3类DNA甲基转移酶基因(CsMET1,CsCMTs and CsDRM1),一个染色质重塑基因(CsDDM1)和去甲基化基因(CsDMEs)。对上述基因在不同组织以及不同果实发育时期的表达分析发现,CsDRM1在幼苗、叶片和花中呈现高表达;在果实发育过程中,CsMET1、CsCMT1、CsCMT2、CsDRM1、CsDMEs在果皮中偏好表达。通过对全基因组甲基化水平的测定和DNA甲基化相关基因的表达分析,说明全基因组甲基化图谱的建立是由甲基化和去甲基化共同作用形成的,且随着生长发育过程而变化。2.5-氮胞苷处理诱导愈伤中类胡萝卜素的降解为了探究DNA甲基化在类胡萝卜素中的调控作用,本研究利用去甲基化试剂5-氮胞苷(5azaC)对高积累类胡萝卜素的愈伤系进行了梯度处理。随着处理浓度的升高,愈伤中类胡萝卜素的含量逐渐降低。上游类胡萝卜素的降解也造成了下游ABA含量的下降。对类胡萝卜素代谢途径中的基因表达分析发现,CpCCD1被大量诱导上调表达。原核表达CpCCD1蛋白到类胡萝卜素工程菌中的实验证实,CpCCD1对玉米黄质、β-胡萝卜素、番茄红素有较强的降解作用。此外,本研究发现5azaC处理虽然造成了全基因组范围内的去甲基化作用,但仍然有一些位点的甲基化水平升高。进一步对控制DNA甲基化的基因进行表达分析发现,5azaC处理可以诱导DNA甲基转移酶基因的表达,推测这些基因的上调表达造成了处理后某些位点甲基化水平的升高。对处理前后愈伤的表达谱分析发现,3380个基因在处理后差异表达,其中2047个基因上调表达,1333个基因下调表达,同时发现MYBs、WRKYs、NACs等大量的转录因子在处理后被激活。进一步的甲基化组分析发现5azaC的去甲基化作用主要发生在基因间区和基因的上游2kb和下游2kb区域。通过筛选,共鉴定出3082个甲基化差异基因(包括基因的启动子区和基因区),其中包含682个上调基因和2400个下调基因,说明5azaC处理造成了广泛的全基因组范围内的去甲基化作用。对甲基化差异基因的功能分类进行分析发现,差异基因主要分布在蛋白质水解、转录因子、信号转导、逆境响应、激素代谢等途径。3.柑橘胚珠发育过程中发生了全基因组范围内的甲基化修饰本研究利用甲基化免疫共沉淀结合高通量测序(MeDIP-seq)的方法首次对柑橘胚珠发育过程中的甲基化组进行了解析。以红夏橙开花前10天(多胚起始前)和开花后15天不授粉(多胚起始后)的胚珠为材料进行甲基化组分析,共鉴定了2349个甲基化差异基因,其中2245个基因上调,104个基因下调,大部分基因的甲基化水平上调说明在这两个时期发生了全基因组范围内的加甲基化修饰。克里曼丁(单胚)受精前后(开花前~1天;开花后15天)的胚珠中也发现了全基因组范围内的加甲基化现象。推测在配子形成过程中发生去甲基化重排后,本研究选取的胚珠组织正处于重新恢复甲基化的阶段。对红夏橙多胚起始细胞发育前后两个时期胚珠的转录组分析共得到1361个上调表达基因和1126个下调表达基因。功能分类显示差异表达基因主要参与激素信号转导、蛋白质水解以及微管等生物学过程。进一步基于前人通过遗传学定位的多胚控制区域,分析了该区域内甲基化变化的基因,并在该区域筛选出了可能与胚发育相关的候选基因。4.全基因组范围内鉴定和分析组蛋白修饰基因基于已测序的甜橙基因组序列,共鉴定了136个组蛋白修饰基因,其中包括四类修饰基因:组蛋白甲基转移酶基因(47个)、组蛋白去甲基化基因(23个)、组蛋白乙酰化基因(50个)以及组蛋白去乙酰化基因(16个)。根据序列特点,将上述基因分为11个基因家族,并对这些基因的染色体分布、基因聚类、基因结构以及保守结构域进行了分析。为了研究这些基因在柑橘果实发育过程中的潜在作用,对筛选出的42个果实高表达基因在6个果实发育时期进行了表达分析,鉴定出了一系列与果实成熟相关的组蛋白修饰基因。进一步对这些基因在响应青霉菌(Penicillium digitatum)侵染果实过程中的表达进行了分析,共筛选出了20个青霉菌侵染响应基因。基于这些分析结果,从中挑选候选基因CsSDG7进行转基因功能验证,发现在山金柑中干涉CsSDG7后,转基因系可以出现早花的表型。