血管增生(angiogenesis)是指在原有血管网基础上形成新的毛细血管的过程。又被称作为血管新生(neovascularization)。在创伤、月经周期以及外周循环闭塞等情况下血管增生具有恢复血供和促进伤口愈合的积极作用。但更多的情况下，血管增生参与疾病的发生与发展。病理性血管增生见于糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、动脉粥样硬化、慢性风湿性关节炎等多种疾病。病理性血管增生也在肿瘤的发生、发展、转移和复发过程中扮演了非常关键的角色，因而阻断或抑制血管增生是抗肿瘤治疗的有效策略。近年来以血管增生为靶点治疗肿瘤已成为肿瘤治疗研究的热点，有多种血管增生抑制剂相继进进临床试验阶段。　　 人纤溶酶原裂解片段Kringle5(简称K5)是新近发现的一种内源性血管增生抑制因子，是抗血管增生活性最强的人纤溶酶原(plasminogen Plg)裂解片段，包含了Plg中Pro452-Ala542之间氨基酸序列，约有91多个氨基酸残基，表观分子量约为16kDa。k5空间结构由一个完整的Kringle结构域和两侧氨基酸臂组成，其中80个序列严格保守氨基酸残基组成了Kringle结构域，且该结构域由3个二硫键连接而成。　　 我们早期研究也证实了K5具有特异性抑制血管内皮细胞增殖和诱导内皮细胞凋亡的作用；在视网膜血管增生和糖尿病大鼠模型中均发现K5能降低血管渗漏；在视网膜血管增生大鼠模型中我们进一步观察到K5及其突变体能预防和阻断新生血管的形成；同时应用相同来源的K5滴眼液证实K5亦可抑制兔角膜的血管增生。最近本实验室在HepA肝癌皮下种植瘤模型上观察到K5能显著降低肿瘤组织中微血管密度(microvessel density，MVD)和抑制肿瘤生长。同时还发现k5对某些高转移性肿瘤细胞(Bel7402肝癌细胞、PC-3-M高转移性前列腺癌细胞、PG转移性肺癌细胞和Lewis肺癌细胞转移株等)的运动和迁移有明显的抑制作用，并且在高转移Lewis肺癌肿瘤模型上发现k5可以抑制Lewis肺癌细胞自发性肺转移。　　 我们前期的研究还发现其抗血管增生活性与kringle结构域的完整性(三个二硫键的完整性)密切相关，并且发现k5-N端10个氨基酸缺失突变体的抗血管增生活性更强。而其N端含有5个的电负电荷的酸性氨基酸，有文献报道Kringle结构域内与K5活性相关的“赖氨酸结合口袋”—其核心序列RKLYDY含两个关键的带正电荷的精氨酸残基Arg69和赖氨酸残基Lys70，去作Arg69和Lys70后，其活性消失。据于此我们前期的研究通过点突变技术将k5-N端5个酸性氨基酸置换为中性氨基酸苏氨酸，在原核表达系统表达了His标签的k5突变体融合蛋白，结果在体外实验中我们发现该突变体蛋白比k5的抑制人脐静脉内皮细胞生长增殖的活性更强。但是该突变体蛋白为融合蛋白，且含有23个外源氨基酸残基，这制约了其今后在临床上的运用。　　 据于K5在体内和体外实验中表现出显著抑制血管增生的作用，我们分析K5具备潜在的抑制恶性肿瘤和血管增生相关疾病的临床运用价值。但K5完整多肽已获美国专利(美国专利序号08/832，087，1997年4月3日，美国伊利诺伊州艾博特公司)和中国专利(公开号CN1223690A，1997年7月21日)保护。因而通过基因工程的方法构建无外源氨基酸的K5的突变体不仅可以研究K5结构与功能的关系，也可以制备具有自主知识产权的和具有潜在抑制肿瘤和血管增生性疾病的基因工程药物。　　 本研究利用pGEX-4T-1/BL21(DE3)原核表达系统优化引物设计得到去除外源氨基酸的K5突变体，同时对K5-N端5个酸性氨基酸进行突变。本研究将在体内和体外实验中分析K5-N端5个带负电的酸性氨基酸残基与其抗血管增生活性之间的关系，进一步明确K5结构与功能的关系；同时为制备具有抑制血管增生和抗肿瘤作用的无外源氨基酸K5m5基因工程蛋白药物提供技术方案。开发具有自主知识产权的和具有潜在抑制肿瘤和血管增生性疾病的基因工程药物打下坚实基础。　　 研究目标　　 1、通过pGEX-4T-1/BL21(DE3)原核表达系统获得去除外源氨基酸的K5突变体k5m5蛋白。　　 2、体内和体外实验证实无外源氨基酸的K5突变体k5m5蛋白具有抑制血管增生的活性和抑制裸鼠肝癌实体瘤的生长的作用。　　 研究内容与结果　　 第一部分：获得分子量更小、无外源氨基酸序列、高纯度的k5m5蛋白　　 (1)pGEX-4T-1/k5m5重组质粒的构建。以我们实验室构建保存的pET22b(+)/k5mut5cDNA为模板，设计引物(正向引物：CGT GGATCCCCATCTGTATCGACTCCTTCC;反向引物：5-CCG CTCGAG TCA CGC ACACTG AGG GAC-3)，采用PCR法得到K5m5基因。利用基因工程技术，将目的基因克隆至pGEX-4T-1的BamHI和XhoI位点。测序结果表明目的基因片段与pGEX-4T-1连接无误，阅读框架正确，pGEX-4T-1/k5m5重组质粒构建成功。　　 (2)GST-k5m5融合蛋白的表达、纯化。鉴定正确的pGEX-4T-1/k5m5重组质粒转化到BL21(DE3)宿主菌中，BL21(DE3)/pGEX-4T-1/k5m5工程菌37℃振荡培养至OD600达0.6，0.6nmol/l的IPTG25℃低温诱导6h～10h，表达出可溶性重组蛋白。诱导表达的细菌经超声后，离心取上清，用GST亲和柱Glutathione Sepharose4B纯化，获得高纯度可溶性融合蛋白。对纯化的融合蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western-blot分析鉴定，结果显示得到分子量约为37kDa的GST-k5m5融合蛋白。　　 (3)凝血酶切割GST-k5m5融合蛋白后的再次分离纯化。用凝血酶对融合蛋白进行切割，用GST亲和柱Glutathione Sepharose4B去除GST标签后，采用超滤方法分离获得k5m5蛋白。得到的蛋白经抗k5血清Western-blot分析显示有明显的免疫杂交带。　　 第二部分：体内和体外实验验证k5m5蛋白具有抗血管增生活性和抑制裸鼠肝癌实体瘤生长的作用　　 (1)K5m5蛋白特异性地抑制HUVECs的增殖MTT增殖实验分析发现k5m5特异性抑制人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的增殖，并呈明显的浓度依赖关系。结果还发现k5m5蛋白比k5蛋白具有更强的抑制人脐静脉内皮细胞的增殖作用。用80～1280nmol/L k5m5蛋白分别处理正常肝细胞(chang live cell)、肝癌细胞(Bel7402)与PBS对照组细胞相比，各处理组细胞存活率变化无显著差别。k5m5蛋白对正常肝细胞、肝癌细胞(Bel7402)的生长增殖无明显作用。间接说明K5m5抑制HUVECs的增殖具有特异性。　　 (2)K5m5蛋白诱导HUVECs凋亡，而对正常肝细胞、肝癌细胞(Bel7402)无诱导凋亡的作用　　 Annexin V-PI双染法标记凋亡细胞，流式细胞仪分析K5m5蛋白诱导HUVECs凋亡，而对正常肝细胞、肝癌细胞(Bel7402)无诱导凋亡的作用，结果发现浓度为320nmol/L k5m5处理组内皮细胞凋亡率显著地高于PBS对照组，表明k5m5具有诱导内皮细胞凋亡的作用。而80～1280nmol/L各浓度的k5m5蛋白处理组对正常肝细胞和肝癌细胞(Bel7402)的凋亡与阳性对照组和阴性对照组相比，没有表现出能明显诱导凋亡的作用。　　 (3)K5m5蛋白抑制裸鼠肝癌(Bel7402)实体瘤生长的效应接种Bel7402肝癌细胞后第24天，肉眼可见PBS对照组与k5m5处理组及k5处理组裸鼠颈背部皮下肿瘤生长体积大小出现差异。自腹腔注射k5m5第一次起连续观察32天后处死裸鼠，剥瘤称重，计算和比较各组瘤均重，结果显示：k5m5蛋白及k5蛋白总剂量均为12.5mg/kg时，对BALB/c裸鼠肝癌(Bel7402)实体瘤生长具有显著的抑制作用，抑瘤率分别为68％、63.8％。说明k5m5蛋白比k5蛋白具有更强的抑制裸鼠肝癌实体瘤生长的效应。　　 (4)K5m5蛋白抑制裸鼠肝癌(Bel7402)实体瘤血管增生采用抗血管内皮细胞CD34抗体，用链霉素抗生物素蛋白-过氧化氢酶(SP免疫组织化学方法)法进行鉴定，DAB显色，苏木素染核，棕黄色环状物为血管阳性表达。结果表明K5m5处理组和k5处理组均降低肿瘤组织中微血管的密度(MVD)。但k5m5蛋白处理组的抑制作用更强。　　 结论及意义　　 1、成功构建了pGEX-4T-1/k5m5重组质粒，并获得无外源氨基酸序列的基因工程蛋白k5m5。为其功能研究打下基础。　　 2、无外源氨基酸序列的k5m5蛋白有抑制血管内皮细胞生长增殖和诱导的血管内皮细胞凋亡的活性。k5m5蛋白具有抑制血管增生性疾病的潜在价值。　　 3、无外源氨基酸序列的k5m5蛋白具有抑制裸鼠肝癌实体瘤生长的作用。可以为肝癌等恶性肿瘤的治疗提供新的具有自主知识产权的有效候选基因工程药物。　　 4、体内外实验发现无外源氨基酸序列的k5m5蛋白比K5蛋白具有更强的抑制血管增生活性和抑制肿瘤生长的作用。该研究回答了K5N端5个酸性氨基酸残基可以抑制其抗血管增生作用的科学问题，进一步明确了K5结构与功能的关系。