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研究背景:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是与年龄相关的进行性神经系统变性病,主要导致认知功能障碍,其神经病理学改变以细胞外淀粉样斑块（amyloid β-peptide,Aβ）的沉积和细胞内磷酸化Tau蛋白形成的神经纤维缠结（neurofibrillarytangles,NFTs）为特征。其中约10%左右的AD患者发病年龄＜65 岁,称为早发性家族性 AD（Early-onset familial AD,EOFAD）。早老素（Presenilin,PS）基因突变是导致EOFAD的主要原因。PS2基因包含两种同源蛋白:早老素1（Presenilin1,PS1）和早老素 2（Presenilin2,PS2）。PS1 和 PS2 是γ-分泌酶复合物的催化核心,其对淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）的膜内蛋白进行切割、水解,可形成Aβ。目前全球报道的PS1突变已有300多个,但PS2突变较为罕见。研究发现并非所有致病性的PS1或PS2 FAD突变都会导致Aβ42产生增加或Aβ42/40 比值的升高。大量研究表明AD神经元存在线粒体功能障碍和结构差异。线粒体动力学失衡导致的线粒体功能障碍可能是AD早期且突出的特征之一,研究数据表明它独立存在并且可能位于Aβ沉积或Tau缠结形成的上游,这可能在AD的病理分子级联中起到关键作用,提示线粒体动力学功能障碍在AD的病理机制中起着核心作用。PS2蛋白的完整功能及其在AD发病机制中的作用尚未确定。最近的研究表明,PS2在多个方面参与了线粒体功能的调控,如PS2可调节线粒体与内质网接触的形成和这两种细胞器之间的Ca2+交换等。因此,进一步揭示PS2在细胞代谢等多种生物过程中的作用对于深入了解其生理功能至关重要,并以此为理论基础为进一步探索PS2突变与AD发病的相关性提供潜在的研究靶点。在基因研究中,通过基因敲低（如RNAi）等技术后进行转录组测序来寻找差异表达基因是目前基因研究常用的实验方法。因此,本研究拟首先通过对PS2基因敲低后的SH-SY5Y细胞进行转录组测序分析,探索其在转录组水平mRNA差异表达情况及其基因本体（gene ontology,GO）及京都基因和基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）富集分析结果,最终挑选差异表达显著基因进行验证,结合功能富集和通路富集分析等方法,进而探讨PS2潜在的参与调控AD发病的相关分子调节机制,以及是否参与线粒体功能调节等,并着重对PS2基因敲低后与线粒体动力学调控机制相关的差异基因进行验证,分析PS2调控线粒体动力学在AD发病中的作用机制。此外,根据既往研究报道的PS2 D439A突变未导致Aβ42产生增加,PolyPhen-2软件致病性评估提示该突变为很可能的致病突变（probably damaging）,但其具体致病性及其机制尚无确切研究。目的:探讨PS2突变介导的线粒体动力学失衡在AD发病中的作用机制。方法:通过构建PS2慢病毒介导的RNAi干扰载体,利用PS2 siRNA慢病毒感染的SH-SY5Y细胞构建PS2基因敲低细胞株,样品提取总RNA后,去除其中的核糖体RNA,进行文库的构建,利用转录组测序对PS2表达受抑制后的测序数据进行质控及序列对比分析,获得mRNA差异性表达结果,并以错误发现率（false discovery rate,FDR）＜0.05 且 |log2fold change|＞1 的基因为具有差异显著的mRNA,最终对其进行GO/KEGG富集分析及疾病本体（Disease Ontology,DO）富集分析,筛选可能参与调控线粒体动力学及AD发病相关的差异基因,实时荧光定量PCR分析（Quantitative Real-time PCR,qPCR）验证转录组结果,并进行功能验证实验,探讨PS2敲低后的差异基因在调控线粒体动力学的潜在机制。通过构建PS2 D439A突变的慢病毒载体,构建了 PS2 D439A突变型SH-SY5Y细胞系,根据第一部分转录组测序差异基因的筛选结果在PS2 D439A细胞中进行相关差异基因验证及功能验证,采用Western blot分析对线粒体动力学相关蛋白的表达变化进行验证,利用透射电镜技术观察细胞线粒体形态变化,采用 JC-1 线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）和活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）检测试剂盒评估线粒体功能,最后采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）对细胞活性进行检测,Hoechst 33342染色观察细胞凋亡,以此判断PS2 D439A突变与线粒体动力学相关性在AD发病中的潜在作用机制。结果:1.转录组结果发现在PS2基因敲低前后有差异表达的mRNA共166个,其中上调42个,下调124个,对其进行GO富集分析结果主要富集在神经系统发育、神经发生、神经元分化、突触组织及其调节、神经元发育等。2.KEGG富集分析显示在差异基因中显著性富集的是5-羟色胺能突触,此外还富集海马信号通路、多巴胺能突触、突触囊泡循环、γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid,GABA）能突触、Rap1 信号通路等,进一步对每条 pathway 中的差异基因分析发现一类调控GTPases活性或GTPases结合的基因为G蛋白γ亚基 3（G protein subunit gamma3,GNG3）、JUN 原癌基因（Jun proto-oncogene/AP-1 transcription factor subunit,JUN）、Rap 鸟嘌呤核苷酸交换因子 5（Rap guanine nucleotide exchange factor 5,RAPGEF5）等,GO 富集在 GTPases 活性调节的差异基因中表达下调最显著的为Rho鸟嘌呤核苷酸转换因子5（Rho guanine nucleotide exchange factor5,ARHGEF5）。3.疾病本体DO富集分析发现差异基因与认知功能障碍的发生关系最为密切,还与AD的发病相关。4.对富集于GTPases活性调控的显著差异基因进行qPCR验证,结果与转录组测序结果一致,其中PS2 siRNA细胞中ARHGEF5的mRNA水平降低最为显著,经检测细胞的GTPase活性整体上是降低的。5.PS2 D439A突变细胞中ARHGEF5表达显著降低,细胞整体GTPases活性及Miro2-GTPase活性均降低。6.首次发现PS2可以与Miro2相互结合,PS2 D439A突变降低了 PS2与Miro2间的相互结合作用。7.PS2D439A突变导致Miro2表达降低,同时Mfn1、Mfn2和Drp1的总蛋白表达显著降低,而线粒体中Drp1表达升高,导致线粒体融合/分裂动力学失衡。8.PS2 D439A突变细胞的线粒体膜电位下降及ROS水平显著升高,继而导致细胞活力降低并诱导细胞凋亡增加。结论:PS2基因敲低后可能通过对GTPases活性的调节而参与AD的发病。PS2 D439A突变通过调控Miro2的表达及Miro2-GTPase活性介导的线粒体动力学失衡是其导致AD发病的潜在机制之一。