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氧化亚氮(N2O)是重要的温室气体之一,其增温潜势达CO2的298倍,且其浓度仍呈逐年上升趋势。农田土壤是重要的N2O排放源,而微生物驱动的反硝化过程是N2O还原的主要途径,它由nosZ基因编码的氧化亚氮还原酶(N2OR)将N2O还原成N2。随着更多的好氧反硝化菌逐渐被分离和鉴定,目前有研究发现,从土壤、污水中能筛选得到一些脱氮特性较强的好氧反硝化菌,但主要集中在对其硝酸盐的脱氮能力上,而关于氧化亚氮还原菌的功能特性研究还较为缺乏。研究N2O还原能力强的氧化亚氮还原菌,可以为通过生物途径调控土壤N2O的排放、有效减控温室气体提供科学基础。 本研究利用微生物富集培养分离技术,以KNO3、琥珀酸为底物从稻田土壤中分离得到不同的好氧反硝化细菌;利用nosZ基因和16S rRNA基因测序分析对菌株进行筛选和鉴定;筛选出4株氧化亚氮还原菌为研究对象,通过测定不同菌株在不同条件下N2O的还原量,比较不同菌株还原N2O的能力差异以及分析不同细菌对条件改变的适应性及相关调控因子。主要研究结果如下: 1、从36株反硝化细菌中筛选得到4株含有nosZ基因的氧化亚氮还原菌,编号为:DM15、DM22、DM24、DM27。对这4株氧化亚氮还原菌进行形态学和16S rRNA基因测序分析后,鉴定得出:编号为DM15、DM22的细菌属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、而编号为DM24、DM27的2株菌则属于不动杆菌(Acinetobacter sp.)。 2、筛选到的4株氧化亚氮还原菌在温度30℃、厌氧条件下具有较强的还原N2O能力,4株菌的还原效率分别是64.9%、38.6%、6.8%、8.1%,在该培养条件下,假单胞菌属的还原能力高于不动杆菌;改变不同温度,在20℃、30℃、40℃条件下,30℃是4株菌的最适温度,且菌株受温度升高影响更大,还原N2O效率大幅度减弱。探究不同氧气浓度对菌株还原N2O的影响,在0%、10%、21%的氧气浓度下,4株菌在厌氧条件下还原能力最强,其次是兼性厌氧,然后是好氧。虽然菌株随氧气浓度升高,还原效率降低,但在好氧条件下仍具有一定的还原N2O功能。其中假单胞菌属受氧气浓度抑制程度比不动杆菌属小,尤其是DM15号假单胞菌,在好氧的条件下仍能较多还原N2O。 3、对还原能力最强的Pseudomonas sp.DM15菌株进行全基因组测序分析。结果显示,Pseudomonas sp.DM15菌株基因组大小为6587478bp,包括5969个基因和61.76%的GC含量,COG数据库比对共注释得到25组基因功能分类,其中跟氨基酸运输和代谢相关的基因数最多。GO数据库共检测到38个功能基因分类,其中基因数占比最多的是与生物途径相关的基因、其次是与分子功能相关的基因,与细胞组分相关的基因较少。从KEGG数据库氮代谢途径中得出,该菌含有硝化过程中的nxrB基因,能氧化NO2-,和反硝化过程中的narG、nirS、cnorB以及nosZ基因,能将NO3-彻底还原成N2。Pseudomonas sp.DM15菌在不同条件下甚至在好氧的条件下都能较多地还原N2O,且该菌具有全套的反硝化基因,可能是一株较有应用价值的好氧反硝化细菌。 总之,本研究从稻田土壤中分离筛选得到4株氧化亚氮还原菌,分别是:Pseudomonas sp.DM15、Pseudomonas sp.DM22、Acinetobacter sp.DM24、Acinetobacter sp.DM27,不同的氧化亚氮还原菌在不同环境条件下其N2O的还原能力存在差异,结果证明其中编号为DM15的假单胞菌在不同条件下都具备较强的还原N2O能力,该菌可能为减少土壤N2O排放提供新途径,对利用微生物资源减少土壤氧化亚氮排放提供理论依据。