泥坑白酒是典型的河北本地浓香型白酒,其特点是采用传统手工制曲、泥池发酵,属于传统粗放的自然生产操作方式,产品品质极易受环境条件的影响,因此探究酒曲真菌微生物群落组成及多样性以及优势功能微生物的筛选,为今后浓香型泥坑白酒的规范化生产和工艺的改进提供理论支撑。本研究以河北本地浓香型白酒代表泥坑白酒酒曲为研究对象,结合高通量测序技术、Biolog微平板技术、传统分离培养技术研究了酒曲微生物群落组成及多样性,为改进酒曲质量、提高泥坑白酒的品质等提供理论依据。主要研究结果如下:1.利用温度传感器和烘箱干燥法测定酒曲温度和水分含量,结果显示,制曲过程的五个阶段P1-P5,其酒曲温度呈先升后降的变化趋势,P3阶段达到最高温60℃,之后温度下降至35℃;酒曲水分含量一直呈下降趋势,并且不同部位的水分含量一直表现为里层>中层>表层,整个发酵阶段曲坯温度越高,曲坯不同部位水分含量相差越大,但P5阶段的成品曲并没有很大差异。2.利用Biolog技术分析酒曲微生物群落的AWCD值和多样性指数以及对6类碳源利用情况。结果表明,前8h不同时期酒曲微生物的AWCD值无明显变化,之后开始迅速指数式增长,其中P1时期的AWCD值最大,微生物活性最高,而P4时期酒曲微生物AWCD值最低;表征酒曲微生物功能多样性的McIntosh指数、Shannon指数和Simpson指数表明,在整个培养阶段,五个阶段的样品中P1阶段和P3阶段的多样性指数一直高于其他阶段,P4阶段一直显著低于其他四个阶段;分析对特定培养6种碳源利用情况发现,不同阶段酒曲微生物功能多样性差异性比较显著,并且对不同碳源利用情况也不同。整个阶段的酒曲微生物对氨基酸类、酚酸类及羧酸类利用率较明显,对胺类、聚合物类及糖类的利用率较小。各种代谢特征基本呈现出P1>P3>P2>P5>P4 的状态。3.利用高通量测序对不同发酵时期的酒曲真菌ITS区进行测序,研究真菌微生物群落组成及多样性,结果如下:(1)整个发酵时期的OTU总数是231种,其中共有的OTU数量有20种占比8.66%,表明不同发酵期酒曲真菌群落OTU的相似度并不高,P1时期特有的OTU数量最多占总数的30.3%,说明该时期的物种多样性明显高于其他时期。(2)Alpha多样性分析得到,酒曲真菌群落丰富度、均匀度和多样性一直呈先降后升的趋势,P1和P5时期的酒曲真菌多样性和丰富度较高,P2和P4时期相对较低;PCA分析显示除了 P3和P4时期,另外三个时期各样本点与点之间比较分散,表现出明显的差异,P1时期酒曲物种的聚集程度最差;NMDS分析显示,P2与P5时期的样品距离、P3和P4时期点之间的距离相对较小,P1时期与其余时期样品距离最远,群落结构相似性最小。(3)本研究共鉴定到5个门和49个不同属的真菌,在门水平上,整个发酵期的优势门Ascomycota(子囊菌门)占整个发酵期酒曲的75.78%;在属水平上,随着发酵的进行优势菌属由P1时期的优势菌属Pichia(毕赤酵母属)、Candida(假丝酵母属)和Aspergillus(曲霉属)演变成P2-P5时期的优势菌属Thermoascus(嗜热子囊菌属)、Pichia(毕赤酵母属)和Rhizomucor(根毛霉属);5个不同阶段酒曲真菌在属水平上的丰富度有一定差异,P1时期与其他时期样品表现出明显的菌属多样性和丰度的不同。4.采用传统微生物分离培养方法及分子鉴定方法,分离纯化可培养菌株并分析其发酵过程中真菌菌落数量及种类在时空上的变化,初步鉴定它们的种属地位。结果表明,升温期真菌菌落数增加,60℃时霉菌数量达到最大,为15.6 lg CFU/g,酵母数量达到11.6 lg CFU/g,之后开始下降;大曲成熟期霉菌数量减少,为8.1 lg CFU/g,而酵母未检出;酒曲不同部位的菌群发生演替变化,出现新的物种生成和原有物种消失的现象,部分菌株表现出由表及里逐渐深扎的生长趋势,利用形态特征和分子生物学鉴定特征确定了 20个菌株的种属地位。5.对前期筛选到相对代表性真菌菌株进行功能测定,筛选高酯化力、高液化力、高发酵力及高糖化力的菌株。结果得出,Pichia kudriavzevii和Kazac hstaniaturicensis这2株酵母菌优于其他3株酵母,米根霉Rhizopus oryzae和黑曲霉Aspergillus niger的功能性质比较突出,这四株真菌可作为优势功能菌株继续进行试验优化。