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O-GlcNAc糖基化修饰是一种动态的蛋白质翻译后修饰,广泛存在于植物和动物中,能够影响蛋白的催化活性、亚细胞定位以及与其他蛋白之间的相互作用,参与细胞内的信号转导、能量代谢等重要的细胞生理活动,与多种慢性疾病相关。O-GlcNAc糖基转移酶(OGT)负责催化O-GlcNAc糖基转移反应的发生。在人体内,OGT有三种亚型,即ncOGT、mOGT和sOGT,其结构的主要差异在于N末端TPR序列数目不同。由于三种亚型C末端催化结构域是完全相同的,因此其催化机制以及其与糖基供体的识别机制也应是相同的。因此在本课题中,我们选取了较为容易表达的sOGT作为研究对象,首先对其底物特异性进行了研究。以CKII十七肽为受体底物,我们探索sOGT对26种UDP-GlcNAc衍生物的催化活性。其中,UDP-6-deoxy-GlcNA、UDP-GlcNPr、UDP-6-deoxy-GalNAc和UDP-4-deoxy-GlcNAc四种化合物能够作为sOGT的供体底物。进一步对其中三种化合物的酶学常数的测定表明,UDP-GlcNAc糖基基团的C2位乙酰氨基上的取代、C6和C4位羟基的脱氧取代以及C4位羟基的异构都会削弱sOGT与供体底物的亲合力。通过OGT与底物的分子对接,并经定点突变验证,我们发现sOGT的Leu653的羰基氧和Thr560位的羟基能够与GlcNAc的C4/C6-OH形成氢键；Met501与UDP-GlcNAc的C2位乙酰氨基间的空间较小,不能容纳体积较大的取代基团,而其附近的疏水环境也利于疏水性取代基团的进入。上述结论为进一步了解OGT与糖基供体的相互作用以及其催化机制有一定帮助。已有研究表明,OGT也可以作为自身催化O-GlcNAc糖基转移反应的底物,被糖基化修饰。基于O-GlcNAc修饰的功能,我们认为OGT的自身糖基化参与了对OGT功能的调控。本课题运用多种生物学和化学研究方法对OGT的自身糖基化修饰现象进行了研究,发现了6个糖基化位点(S10, T12, S18, T38, S52, T449, T662),定点突变结果证实其中三个糖基化位点(S18,T38,T449)对sOGT糖基化水平有显著影响。通过对过表达的sOGT在细胞质和细胞核的分布及糖基化水平的研究发现,细胞质内sOGT的糖基化水平更高。通过激光共聚焦显微镜对不同sOGT突变体的亚细胞定位进行观察,与野生型相比较,发现T449A和T662A两个突变体转运入核明显减少,而其它突变体变化不大,这表明T449和T662两个位点可能与sOGT转运入核相关。通过Pull down技术以及生物质谱等研究方法,我们发现糖基化修饰对sOGT互作蛋白有显著影响,糖基化修饰sOGT能够作用的互作蛋白更多,差异蛋白中很多与重要的细胞生理活动相关。O-GlcNAc自身糖基化作为OGT自身调控机制的组成部分,其功能和作用机理尚不清晰,我们的研究对其中部分问题做出了解答,为进一步研究OGT自身调控机制奠定了基础,为OGT相关疾病发病机理的研究提供了参考。