贵州矮马腹泻细菌的分离和鉴定

来源 :贵州大学 | 被引量 : 3次 | 上传用户:longzy773
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贵州矮马是贵州偏远山区的彝族、苗族、回族、水族等少数民族经过长期的人工选育和自然近交形成的珍贵矮马资源,也是仅有的5个中国矮马品种之一。贵州矮马现存栏总数仅仅1400多匹,并且有不断减少的趋势。在饲养过程中发现初生马驹和成年矮马时有腹泻发生,严重影响矮马的养殖。因此为了探究贵州矮马的腹泻病原细菌,本文以腹泻粪样为材料进行细菌的分离鉴定以及毒力试验研究。7份腹泻粪样分别经过SS和XLD培养基、伊红美蓝以及LB培养基进行细菌分离,革兰氏染色观察、生理生化检验以及16S r RNA基因序列比对分析进行鉴定。得到7株沙门氏菌(命名为:S4、S6、S7、S10、S11、S15、S19),7株大肠杆菌(命名为:Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、)和1株肺炎克雷伯菌(命名为T1)。其中分离得到的7株沙门氏菌菌株均可在SS和XLD琼脂培养基上出现典型菌落形态,革兰氏染色呈阴性;生理生化检验结果与沙门氏菌的生化特性相符,将分离的沙门氏菌的16S r RNA基因序列与NCBI收录的沙门氏菌的16S r RNA基因序列进行比对,其相似度在98%~99%;分离的7株大肠杆菌可在伊红美蓝培养基和SS培养基上呈现典型菌落形态,革兰氏染色阴性、生理生化检验符合大肠杆菌的生化特性,这些大肠杆菌的16S r RNA基因序列与NCBI收录的大肠杆菌的16S r RNA基因序列的相似性最高达到99%;分离得到的1株肺炎克雷伯氏菌在LB培养基上呈圆形、隆起、乳白色、边缘整齐带有粘性的菌落,革兰氏染色为阴性,生理生化检验符合肺炎克雷伯氏菌的生理特性,克隆的16S r RNA基因序列与NCBI数据库收录的肺炎克雷伯氏菌的16S r RNA基因序列的相似性最高为99%。通过对7份腹泻粪样进行细菌分离和鉴定,从4份样品中检测出沙门氏菌,检出率为57%;7份腹泻粪样中检测出大肠杆菌,检出率为100%;1份腹泻粪样中检测出肺炎克雷伯氏菌,检出率为14.3%。为进一步探究分离细菌是否存在相应的毒素基因,根据NCBI数据库收录的基因序列设计特异性引物,采用PCR方法分别扩增沙门氏菌侵袭蛋白A(invasion protein gene,inv A)基因和大肠杆菌耐热肠毒素(Heat-Stable toxin,ST)、热敏肠毒素(Heat-Labile toxin,LT)、志贺样毒素Ⅱ(Shiga-Like toxinⅡ,SLTⅡ)、外膜蛋白抗原43(outer membrane protein antigen 43,AG43)基因以及肺炎克雷伯氏菌外膜孔蛋白E(outer membrane protein E,pho E)基因。特异性条带经回收、测序,提交NCBI/BLAST比对,结果表明:分离的沙门氏菌具有侵袭蛋白A基因序列;分离的大肠杆菌只获得了外膜蛋白抗原43基因序列;分离的肺炎克雷伯氏菌具有pho E基因。由此可见,分离获得的菌株均具有毒素编码基因,这些基因能编码毒素蛋白,导致人或动物患肠炎,进而引起腹泻。分离得到的沙门氏菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌虽含有毒素编码基因,但它们的毒力未被证实。因此为探究分离细菌的毒力,选择沙门氏菌S7、大肠杆菌Y1和肺炎克雷伯氏菌T1进行毒力测定。结果表明:沙门氏菌S7对小鼠的半数致死量(LD50)为4.71×102CFU,属于强致病力菌株,大肠杆菌Y1对小鼠的半数致死量(LD50)为3.23×106CFU,肺炎克雷伯氏菌对小鼠的半数致死量为3.01×107CFU。分离的细菌均能够引起试验小鼠腹泻,引起肠,心脏、肝脏、脾脏,肺,肾脏等不同程度的病变,能够导致小鼠死亡。综上所述,沙门氏菌、大肠杆菌中部分菌株以及肺炎克雷伯氏菌都可以导致试验小鼠肠部等发生病变,引发不同程度的腹泻,对试验小鼠具有致死性。可能是贵州矮马的腹泻病原菌,研究结果可为贵州矮马腹泻病的预防和治疗提供理论参考。
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