牛卵母细胞体外成熟过程中核迁移及体外发育的研究

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本试验研究采用地衣红染色方法,对直径为2-8mm牛卵泡卵母细胞体外成熟过程中核迁移过程进行了详细地研究;并通过体外受精,探讨了不同的培养体系对牛受精胚体外发育的影响,为进一步研究牛卵母细胞减数分裂机制和调控以及改善牛早期胚胎培养体系提供科学依据。 研究结果如下: 1、探讨了卵巢性周期、卵丘细胞、成熟培养时间以及牛卵泡液(bFF)对牛卵母细胞体外成熟的影响。结果表明:均得可用卵子数卵泡期卵巢(7.00)极显著高于黄体期卵巢(3.12)(P<0.01),卵泡期卵母细胞核成熟率(80.35%)显著高于黄体期卵母细胞(71.70%)(P<0.05);卵丘-卵母细胞复合体(COCs)的质量影响卵母细胞的体外成熟,A、B级卵母细胞成熟率分别是88.15%(186/211)和68.54%(122/178),两者差异显著(P<0.05);将随机分成三组的卵母细胞分别培养18h(Ⅰ组)、22h(Ⅱ组)和24h(Ⅲ组),Ⅰ组成熟率(69.81%)显著低于Ⅱ组(79.41%)和Ⅲ组(82.93%)(P<0.05);成熟培养液中添加10%的bFF对牛卵母细胞体外核成熟几乎没有影响,但高浓度的bFF(20%、30%)则抑制牛卵母细胞的体外成熟。本试验采用TCM-199成熟培养体系:(TCM-199+3mg/mlBSA+2.5mg/mlTaurine+10ug/mlFSH+100IU/mlGentamycin+5%FBS)能够有效支持卵母细胞体外核成熟,是牛卵母细胞体外成熟培养理想的培养体系。 2、采用传统的醋酸地衣红染色法,详细研究了直径2-8mm卵泡卵母细胞体外成熟过程中细胞核迁移进程,结果发现牛卵母细胞的成熟分裂从GVBD开始,其细胞核逐渐由卵母细胞近中央位置向卵母细胞皮质区迁移,之后同源染色体分开,排出第一极体。卵母细胞成熟后,随着培养时间的延长,M II期细胞核又逐渐远离第一极体端。应用面积积分法处理,得到核成熟进程为:0-5.8h为GV期,持续5.8h;5.8-7.4h为GVBD期,持续1.6h;7.4-9.8h为DK期,持续2.4h;9.8-15.1h为M Ⅰ期,持续5.3h;15.1-18.0h为A Ⅰ/T Ⅰ期,持续2.9h;18.0-24.0h为MII期,持续6h。 3、对比了TCM-199、CRlaa、SOF和mSOF分步培养四种培养体系的培养效果,并探讨了血清对其早期胚胎发育的影响。结果表明:2-细胞胚率和8-细胞胚率4种培养体系之间差异不显著,mSOF分步培养体系的桑椹胚/囊胚的比率为27.3%,显著高于TCM-199培养体系(17.8%)(P>0.05),与CRlaa培养体系(23.6%)差异不显著,SOF培养体系的桑椹胚/囊胚的比率仅仅为3.0%,与其他三组差异极显著(P<0.01);在筛选出的mSOF分步培养体系中72h后用5%FBS替代BSA,以及在培养的全过程中用5%FBS替代BSA所得的2-细胞、8-细胞及桑椹胚/囊胚率均与对照组(无血清组)差异不显著(P>0.05)。
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