哮喘是全球最常见的慢性疾病之一，发病率逐年增高并造成巨大的经济及社会负担，因此研究哮喘的发生、发展及防治，已成为当前人口与健康领域的前沿课题。近年来气道重塑，又称气道重建或重构，被认为是哮喘发病机制中的一个重要环节，它在哮喘发病机制和治疗中的作用越来越受到关注。气道重塑是以气道壁的细胞和分子的组成、数量和结构的变化为特征的一系列慢性损伤和修复过程，主要表现为细胞外基质(extracellular matrix，ECM)沉积、基底膜增厚、气道平滑肌增生和肥大等。作为哮喘的特征性病理变化，气道重塑是哮喘慢性化、持续化、严重化的病理基础，是哮喘中存在的不可逆性气道阻塞及气道高反应性的病理基础，也是激素抵抗性哮喘的病理基础。治疗哮喘必须与防治气道重塑相结合，才是真正意义上的控制。　　神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)是神经营养因子家族中的一个成员，对神经元的生长、分化起到十分重要的调控作用。然而，近年认为NGF与过敏性气道炎症密切相关。NGF可导致人B细胞分化为浆细胞，调节过敏性炎症细胞释放趋化因子及介质，增加中性粒细胞的趋化活性及超氧物质的释放，及嗜碱性粒细胞释放组织胺。这些研究提示NGF在哮喘早期阶段过敏性气道炎症的发生中起非常重要的作用。然而，NGF在哮喘气道重塑中的作用如何鲜有报道。　　近来一些研究证实气道中的一些固有细胞可能是NGF的靶细胞。NGF可刺激体外培养的肺成纤维细胞的收缩、迁移及促进其分化成肌成纤维细胞。NGF可通过TrkA受体诱导气道平滑肌细胞增殖，也可诱导MMP9在血管平滑肌细胞上表达。这些体外研究提示NGF可能作用于体内的肺固有细胞参与气道重塑的形成。　　细胞周期由细胞周期蛋白(Cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent kinase，CDK)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(Cyclin—dependentkinase inhibitor，CKI)进行调节。细胞周期调控是一个受多种调节蛋白协同作用的精细调节过程。目前，cyclin D1在气道平滑肌细胞生物学作用被研究得最多。由于cyclin D1在人或动物的恶性疾病中过表达或体外培养细胞或转基因鼠的试验中有致肿瘤作用，已被确定为原癌基因。在小牛气道平滑肌细胞，血小板源生长因子可诱导cyclin D1转录激活及蛋白合成，进而导致视网膜成瘤蛋白高度磷酸化，使其释放延伸因子E2F，从而激活DNA聚合酶。体外实验研究表明，cyclinD1过度表达与平滑肌细胞的增殖有密切关系，并有研究证实哮喘小鼠模型的肺组织表达较高的cyclin D1。cyclin D1表达增高可促进人气道平滑肌细胞增殖。已有研究证实NGF通过上调cyclin D1蛋白表达促进PC12细胞的增殖。但是cyclinD1在NGF调节哮喘气道平滑肌细胞增殖的作用未见报道。　　本课题从体内及体外两方面，研究NGF对哮喘鼠气道重塑的调节作用并初步探讨相关作用机制，旨在加深对NGF参与哮喘发病机制的理解，为哮喘防治提供有价值的理论依据。本项研究共分三部分:　　第一部分NGF及其中和抗体对哮喘大鼠气道重塑的影响　　目的　　观察NGF及对哮喘大鼠气道重塑及肺组织中基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloprotease-9，MMP-9)表达的影响，探讨它在哮喘中的作用。　　方法　　Wistar大鼠随机分为对照组、哮喘组、NGF组及NGF中和抗体组。卵白蛋白(ovalbumin，OVA)致敏和激发建立哮喘大鼠气道重塑模型;HE染色观察气道结构改变;明胶酶谱法检测各组大鼠肺组织中MMP-9的活性;同时采用real time PCR检测各组MMP-9的mRNA表达水平。　　结果　　(1)NGF组能促进哮喘气道重塑的特征性病理改变;而NGF中和抗体能部分抑制哮喘气道重塑的特征性病理改变;(2) NGF组的羟脯氨酸含量、气道的吸气和呼气阻力、肺组织胶原沉积均显著高于哮喘组，而NGF中和抗体组的羟脯氨酸含量、气道的吸气和呼气阻力、肺组织胶原沉积均显著低于哮喘组，但仍高于对照组;(3) NGF组肺泡灌洗液白细胞总数、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞、IL-4及IL-13水平明显均显著高于哮喘组，而NGF中和抗体组的肺泡灌洗液白细胞总数、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞、IL-4及IL-13水平均显著低于哮喘组，但仍高于对照组;(3)NGF组肺组织MMP-9活性及其mRNA表达水平均明显高于哮喘组，而NGF中和抗体组肺组织MMP-9活性及其mRNA表达水平均明显低于哮喘组，但仍高于对照组。　　结论　　NGF的干预可显著加剧哮喘气道重塑的病理改变，促进气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)的增生;并可通过促进肺内MMP-9的表达及Th2细胞因子（IL-4、IL-13）来加剧哮喘气道重塑的进程。而NGF中和抗体可显著减轻哮喘气道重塑的病理改变，部分抑制气道平滑肌细胞ASMCs的增生。　　第二部分NGF及其中和抗体对气道重塑大鼠的气道平滑肌细胞的作用　　目的　　检测NGF及其中和抗体对气道重塑大鼠的气管平滑肌细胞的增殖和移行及表达MMP-9、cyclin D1的影响，从细胞水平探讨NGF及中和抗体对哮喘气道重塑的作用机制。　　方法　　原代培养论文一中各组气管平滑肌细胞。CCK-8法测定细胞增殖活力，流式细胞仪测定细胞周期，Edu染色检测增殖细胞DNA变化，Transwell检测细胞移行情况;同时用实时荧光定量PCR及蛋白免疫印记法分别检测细胞中MMP-9及cyclinD1的表达情况。　　结果　　(1) NGF组的ASMCs中细胞增殖活力、EdU阳性表达率明显高于哮喘组，并促进了细胞周期中G1/S的转化;而NGF中和抗体组ASMCs细胞增殖活力、EdU阳性表达率明显低于哮喘组，并抑制了细胞周期中G1/S的转化(2) NGF组的ASMCs的移行数明显多于哮喘组，但是NGF中和抗体组的ASMCs明显低于哮喘组;(3) NGF组中MMP-9与CyclinD1的mRNA及蛋白表达水平明显高于哮喘组，而NGF中和抗体组的MMP-9与CyclinD1的mRNA及蛋白表达水平明显低于哮喘组。　　结论　　NGF能促进气道重塑大鼠的ASMCs增殖并上调其MMP-9、cyclin D1表达，而NGF中和抗体能部分抑制这种作用。　　第三部分Cycl in D1在NGF调节哮喘气道平滑肌细胞增殖的作用研究　　目的　　探讨cyclin D1在NGF调节哮喘气道平滑肌细胞增殖的作用。　　方法　　原代培养急性哮喘大鼠ASMCs并随机分为两组:对照组及NGF组。cck-8法测定细胞增殖活力，流式细胞仪测定细胞周期，Edu染色检测增殖细胞DNA变化;用转染的方法沉默cyclin D1基因，同时用实时荧光定量PCR及蛋白免疫印记法分别检测细胞中cyclinD1的表达情况及沉默效率。　　结果　　(1) NGF在50ng/ml浓度并不影响哮喘ASMCs的增殖(P＞0.05)，但其在100、150、200ng/ml均可促进哮喘ASMCs的增殖，但不表现为浓度依赖性，故把100ng/ml浓度作为实验的最佳浓度运用于之后的所有细胞实验;(2)100ng/ml浓度的NGF对哮喘ASMCs的促增殖作用呈现时间依赖性;(3) NGF显著促进哮喘ASMCs中EdU阳性表达率，并促进细胞周期中G1/S的转化;(4) NGF明显上调哮喘ASMCs中的cyclin D1 mRNA及蛋白表达水平;(5) cyclin D1 siRNA转染明显抑制了哮喘ASMCs中cyclin D1的mRNA及蛋白表达水平;(6) cyclin D1 siRNA转染明显抑制了NGF促哮喘ASMCs的增殖作用(7) cyclin D1 siRNA转染哮喘ASMCs后，用NGF刺激哮喘ASMCs，其EdU阳性表达率明显降低，并明显抑制了细胞周期中G1/S的转化;(8)cyclin D1 siRNA转染抑制了NGF上调哮喘ASMCs中的cyclin D1mRNA及蛋白表达水平。　　结论　　NGF能促进哮喘鼠ASMCs的增殖，并上调cyclin D1表达。cyclin D1在NGF促进哮喘ASMCs增殖中起非常重要的作用。