[研究背景]戊型肝炎(Hepatitis E, HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)感染引起的病毒性肝炎,20世纪80年代首次确认此种炳毒为传染病的病原。随着人们对HE研究的深入以及科学技术手段的提高,人们对HE的认识更加深入：HE不仅流行于卫生条件较差的地区,而且发达地区被诊断为HE的病人也日益增多。近年来,HE已成为威胁人类健康的全球性问题：患HE的孕妇病死率可高达30%,慢性肝病基础的患者易感染HEV从而诱发重型肝炎,有关慢性HE的报道也逐渐增多。防控HE疾病已成为科学家日益关注热点。HEV为单股正链RNA病毒,分为4个基因型,其中基因1型、2型及基因3型基因组的结构相似,与基因4型基因组相比,结构差异比较大。我国主要流行基因1型和基因4型。HEV全长约7.2kb,有3个开放读码框(Open Reading Frame, ORF),其中ORF1编码非结构蛋白,ORF2编码戊型肝炎病毒的衣壳蛋白,ORF3则编码个小分子蛋白,且基因1型与基因4型病毒编码的ORF3蛋白的结构存在差异：基因4型ORF3蛋白N端较1型ORF3蛋白缺少9个氨基酸。由于缺乏合适的动物模型和细胞模型,戊型肝炎的发病致病机理并未阐明,且HEV编码的小分子蛋白ORF3蛋白的生物学功能也不明确,不同基因型的ORF3蛋白功能是否存在差异,尚无相关报道。也有文献报道不同基因型致病力也是存在差异的,这种差异的原因值得探讨。本研究拟以Huh7为细胞模型,探讨不同型ORF3蛋白的功能及其存在的差异,并进步研究相关的机制,初步探讨不同基因型的HEV病毒对免疫刺激影响的差异,为戊型肝炎的研究提供一定的理论基础。[目的]探讨基因1型及基因4型ORF3蛋白对肝癌细胞系的影响及存在的差异和可能的机制,且初步探讨基因1型及基因4型HEV病毒对免疫刺激的影响差异,为进一步深入了解戊型肝炎的发病致病机理提供新的科学依据；[方法]1.分别构建1型及4型HEV完整ORF3蛋白(ORF3蛋白)的真核表达质粒,同时利用实验室已有的绿色荧光蛋白标记的ORF3真核表达质粒。质粒转染Huh7细胞：CCK8检测不同型ORF3蛋白对Huh7细胞增殖的影响；PI染色流式细胞仪检测ORF3对细胞周期的影响；Annexin V/PI流式细胞术检测不同型ORF3蛋白对细胞凋亡的影响。2.用基因1型及基因4型ORF3质粒分别(?)染Huh7细胞,Real-time PCR检测细胞周期相关基因cyclinD1及cyclin E的表达,western blot检测cyclinD1、cyclinE、cyclin A、cyclin B等蛋白的表达；Real-time PCR检测细胞凋亡相关Bax、Bcl-xl基因的表达,Western blot检测相关Bax、Bcl-x1、Caspase-9等蛋白的表达；免疫荧光观察不同型ORF3蛋白对p65核转移的影响,并用western blot证实。3.采集健康人的血(检测肝功能正常,戊肝抗体、乙肝抗体及丙肝抗体阴性),Ficoll法分离外周单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC),用不同型的戊型肝炎病毒刺激外周单个核细胞,倒置显微镜观察PBMC的生长情况,ELISA检测INF-γ及IL-4细胞因子分泌情况。[结果]1.成功构建了基因1型及基因4型ORF3的真核表达载体；基因1型ORF3可以抑制肝癌细胞系Huh7增殖活性(p<0.05),基因4型无统计学差异；基因1型ORF3蛋白可阻滞细胞周期于G0/G1期,而基因4型ORF3蛋白则对细胞周期无明显抑制作用；基因1型和基因4型ORF3蛋白均可抑制星形孢菌素所诱导的细胞凋亡。2. Real-time PCR示ORF3蛋白的表达可以抑制cyclinD1及cyclin E的表达,基因1型及基因4型ORF3蛋白均可。western blot示表达基因1型ORF3的细胞其蛋白cyclinD1、cyclinE及相关的细胞周期依赖性蛋白激酶CDK4、CDK6、CDK2蛋白表达量与对照组相比均有下降,但是基因4型则无明显差异。表达基因1型及基因4型ORF3蛋白的细胞其S期,和G2期相关的细胞周期蛋白cyclinA及cyclin B的蛋白表达量与对照组比较表达量无差异；3.Real-time PCR示基因1型及基因4型ORF3蛋白均可抑制Bax及Bcl-2基因的表达。凋亡相关蛋白的检测示：对照组及转染空载质粒组加入促凋亡剂后Bax、caspase9、细胞色素c的表达与转染ORF3质粒组相比,明显增高。4.激光共聚焦显示,表达ORF3蛋白的细胞,加入TNF-α刺激后,p65并未出现核转移,基因1型和基因4型无差异；western blot显示：表达ORF3蛋白的细胞在受到TNF-α刺激后胞核p65的表达量较对照组相比下降,且基因1和4型间无显著差异。5.PBMC加入不同型HEV刺激后,随着时间的推移可见PBMC从单个散在的状态逐渐出现聚团,且聚团的数量逐渐增多,体积变大,与基因4型相比,加入基因1型HEV的PBMC聚团出现的时间更早,且聚团的数量更多,体积更大；而没有加入病毒的PBMC从2d-9d处于单个散在状态,未见明显细胞聚集的现象。6. ELISA检测PBMC培养上清中细胞因子INF-γ及IL-4的分泌量,INF-γ的分泌量高于基因1型组及对照组,而各组IL-4分泌量则小于最低检测浓度。[结论]1.基因1型ORF3蛋白和基因4型ORF3蛋白对Huh7细胞的影响是存在差异的,基因1型ORF3蛋白可以抑制细胞增殖活性且阻滞细胞周期于G0/G1期,而基因4型ORF3蛋白无统计学差异。基因1型和基因4型ORF3蛋白均可抑制新型孢菌素诱导的细胞凋亡。2.基因1型ORF3可能通过抑制cyclinD1及cyclinE蛋白的表达使细胞停滞于G0/G1期；基因1型及基因4型ORF3蛋白通过线粒体途径抑制星形孢菌素诱导的凋亡3.基因1型及基因4型ORF3蛋白均可抑制TNF-α诱导的p65核转运。4.与基因4型HEV相比,基因1型HEV可以诱发更早、更强烈的免疫反应。