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嗜热微生物是一类在高温环境中生存的极端微生物,是科学研究和工业生产中极为重要的生物资源。腾冲嗜热厌氧菌是一种从云南省腾冲地区的热泉中分离出来的嗜热微生物,是一个较为理想的嗜热微生物研究模型;而且它的前期基因组和蛋白质组研究为进一步探索该菌嗜热相关分子机制奠定了基础。 本课题中,我们从分析不同温度下培养的腾冲嗜热厌氧菌的差异蛋白质组出发,结合其他的实验证据,诸如基因组、转录组和分子生物学等,探讨嗜热菌在高温条件下其基因表达的调控机制,试图建立它的嗜热分子调控模型。 我们选取四个温度(55、65、75和80℃)培养腾冲嗜热菌,采用高通量标记定量蛋白质组学方法—iTRAQ方法,比较不同生长温度下蛋白质的丰度变化。我们从技术角度对实验流程进行了优化,即采用高pH反相色谱改善肽段的色谱分离,优化Orbitrap质谱仪参数设置提高肽段的鉴定和定量,评估iTRAQ标记定量数据分析软件寻找最适合的数据处理策略。基于优化的iTRAQ实验流程,并设定严格的数据质量控制和差异蛋白质筛选标准,我们共鉴定到1589个腾冲嗜热菌蛋白质,其中251个为温度依赖性蛋白质。进一步的功能分类分析表明,这些温度依赖性蛋白质主要富集在几个重要的功能上,如能量产生转化、糖转运代谢和分子伴侣蛋白等。这提示在环境温度改变时,腾冲嗜热菌可能通过显著改变这些蛋白质的丰度来适应环境变化,而相应的生物功能活性增强或减弱则体现了嗜热菌的温度适应能力。 我们开展了腾冲嗜热菌温度依赖性蛋白质的编码基因的基因组定位分析,发现其中80个基因在基因组序列分布上形成了30个聚集的基因簇,而且这些基因簇都具备操纵子的结构特点。通过转录组测序,我们证明了这些基因簇内的基因是共转录和共调控的。同时,定量转录组数据显示随着培养温度的升高,这些编码温度依赖性蛋白质的基因转录水平呈现与蛋白质丰度相一致的变化趋势。我们推论,腾冲嗜热菌以操纵子为单位的转录调控是一种十分高效的温度适应性反应,而其引起的温度依赖性蛋白质丰度变化,使得嗜热菌能够迅速调整细胞内代谢和信号通路活性,有效满足细菌在高温下的生存需求。 既然腾冲嗜热菌中存在一组对温度敏感的操纵子,我们假设这些操纵子可能受到同一类全局转录调控因子的影响。因此,我们深入探索了这类蛋白质因子存在的可能性。我们对6个温度依赖性操纵子的启动子序列进行了DNA亲和层析和DNA结合蛋白的质谱测定,鉴定到一个与这些操纵子特异性结合但是功能未知的蛋白质,即TTE2455。氨基酸序列分析表明,该蛋白在嗜热厌氧菌目中高度保守,而空间结构解析则显示,该蛋白含有HTH(螺旋-转折-螺旋)和TPR(三角形四肽重复序列)两个保守结构域。我们进一步利用体外EMSA实验和体内ChIp实验,验证了TTE2455蛋白质的确能够与温度依赖性操纵子的启动子序列发生相互作用。我们得出结论,TTE2455是一个重要的全局转录调控因子,它可能在腾冲嗜热菌适应环境温度变化过程中扮演重要角色。 在温度依赖性蛋白质组及其功能分类、温度相关的操纵子结构以及全局转录调控因子发现等实验数据基础之上,我们构建了一个腾冲嗜热菌嗜热过程中能量代谢途径相关蛋白质表达的调控模型,提出了一种嗜热菌适应环境温度变化的主动调控分子机制。