原发性肝细胞肝癌(HCC)是世界范围内第五大常见肿瘤,也是我国常见的消化系统肿瘤。并且有着进展快、术后复发率高以及预后不良的特点。原发性肝细胞肝癌的易于成血管性是导致其预后不良的最主要因素之一。这种生物学特性使肿瘤更易于扩散,导致毗邻脏器浸润和远处脏器的转移。从一定程度上讲,原发性肝细胞肝癌这种术后易复发的特点给传统的放化疗带来了巨大的挑战。所以,有必要通过确认新的标记物来筛选出那些行根治性切除术后易复发的患者。对他们再次行有效的辅助治疗,这样能够更好的提高原发性肝细胞肝癌的根治效果,改善患者预后。癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM1)是癌胚抗原(CEA)超家族成员。在一些免疫细胞及上皮细胞中均可以检测到CEACAM1的表达。过去的研究发现,就肿瘤细胞的生长和进展而言,CEACAM1l在不同的恶性肿瘤类型中发挥着不同的作用。比如,相比正常组织,CEACAM1在乳腺癌、结肠癌、前列腺癌以及子宫内膜癌组织中表达明显减少。已有的文献证实,在乳腺癌和前列腺癌组织中,CEACAM1对肿瘤细胞的生长起着负调节作用,也就是说在这两种类型的恶性肿瘤中CEACAM1发挥着抑癌作用。相反的,在正常的肺组织、肺细胞和黑色素细胞中鲜有CEACAM1的表达,而在肺腺癌和黑色素瘤中CEACAM1的表达似乎可以促进肿瘤细胞的生长和转移,提示肿瘤预后不良。以往的文献报道发现,在原发性肝癌细胞中CEACAM1表达水平降低,而CEACAM1在原发性肝细胞肝癌组织中的表达缺失提示了肿瘤的不良预后。近期的研究发现,在口腔癌组织中,CEACAM1分为细胞膜表达和细胞浆表达两种类型,而CEACAM1不同的表达类型在肿瘤的微血管生成和微淋巴管生成中发挥着不同的作用。目前来讲,并没有关于不同类型的CEACAM1在原发性肝细胞肝癌组织中表达的文献报道。其不同表达类型是否也像口腔癌中的CEACAM1一样在肿瘤的进展、血管生成以及预后中发挥了不同的作用,更不得而知。对于可溶性CEACAM1的研究,目前报道较少。有研究发现,在健康人外周血清中可检测到可溶性CEACAM1的存在。而在胆管性疾病患者外周血清中,则发现可溶性CEACAM1的水平明显增高,这包括原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎以及胆管上皮癌。另外最近的研究发现,相比健康人群,在胰腺癌患者血清中的CEACAM1的表达水平明显增高,并且其似乎可以作为诊断胰腺癌的一个潜在肿瘤标记物。Markel等人在黑色素瘤患者的研究中同样发现这种可溶性的CEACAM1在患者血清中的表达水平明显增高。虽然一些研究者对血清中可溶性CEACAM1做了一些前期研究。但就目前来讲,对人血清中可溶性CEACAM1的量化仍然没有一个统一的检测标准。另外,对于血清中这种可溶性CEACAM1在原发性肝细胞肝癌中的表达未见有报道,其在原发性肝细胞肝癌中起到怎样的作用也不得而知,这些都需要进一步的深入研究。第一部分CEACAM1在原发性肝细胞肝癌组织中的表达及其意义研究目的：本部分主要研究癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM1)在原发性肝细胞肝癌中的表达方式。分析不同的表达方式与不同临床病理指标之间的相关性,以及不同表达方式和肿瘤微血管生成以及和原发性肝癌切除术后预后之间的关系。研究方法：山东大学齐鲁医院伦理委员会批准这个研究协议。获取山东大学齐鲁医院普外科97例原发性肝细胞肝癌患者肿瘤标本。1. CEACAM1和CD34在原发性肝细胞肝癌组织中的表达检测：获取原发性肝细胞肝癌标本,制备蜡块后切片,免疫组化法检测CEACAM1以及CD34在原发性肝细胞肝癌组织中的表达。2.原发性肝细胞肝癌组织中不同表达类型的CEACAM1和患者临床病理指标之间的相关性分析：采用Chi-square检验对CEACAM1不同表达类型各亚组与患者临床病理资料之间进行比较,分析其相关性。3.原发性肝细胞肝癌组织中不同表达类型的CEACAM1对原发性肝癌患者根治性切除术后预后的影响分析：采用Kaplan-Meier分析绘制生存曲线,Log-rank检验用于分析原发性肝细胞肝癌组织中不同类型CEACAM1表达对原发性肝癌患者根治术后无瘤生存期的影响。结果：1.在97例原发性肝细胞肝癌的肿瘤标本中有91例标本检测到CEACAM1的表达。其中53例为细胞膜表达,38例为细胞浆表达。2.在原发性肝细胞肝癌组织中CEACAM1表达类型与原发性肝癌的肿瘤大小、肿瘤数目、肿瘤有无血管侵犯、肿瘤有无卫星灶存在、Edmondson-Steiner分级、TNM分级以及肿瘤微血管密度(MVD,以CD34表示)密切相关(p<0.05),而与患者性别、年龄、血清HBsAg阴阳性、血清抗HCV抗体阴阳性、是否存在肝硬化、血清ALT水平、血清AST水平、血清GGT水平等无明显相关性(p>0.05)。3.肿瘤标本为肝癌细胞浆型CEACAM1表达的原发性肝癌患者3年无瘤生存期(中位生存期=21.5月,3年无瘤生存率26.3%)明显低于标本为细胞膜型CEACAM1表达的患者(中位生存期=36月,3年无瘤生存率52.8%)(p=0.005)。多因素分析结果显示：CEACAM1胞浆表达可以作为判断原发性肝癌术后复发的独立因素(p=0.031)。结论：1.原发性肝细胞肝癌组织中CEACAM1的表达存在肝癌细胞浆型和肝癌细胞膜型两种表达形式。2.原发性肝细胞肝癌组织中CEACAM1细胞浆表达和肿瘤进展、肿瘤微血管生成以及患者预后不良相关。3.原发性肝细胞肝癌组织中CEACAM1细胞浆表达可以作为预示原发性肝癌易于复发的一个指标。并且将来有可能作为原发性肝癌切除术后后续抑制肿瘤新生血管生成治疗的一个新型潜在靶点。第二部分可溶性CEACAM1在原发性肝细胞肝癌患者血清中的表达及其意义研究目的：研究可溶性CEACAM1在原发性肝细胞肝癌患者血清中的表达及其与患者临床病理指标之间的关系。探讨可溶性CEACAM1在原发性肝癌患者中表达的可能作用。研究方法：山东大学齐鲁医院伦理委员会批准这个研究协议。获取50例健康自愿者及山东大学齐鲁医院普外科124例原发性肝细胞肝癌患者外周血血清；获取其中26例原发性肝癌患者肿瘤标本。所有患者及健康自愿者均签订书面赞同协议,研究协议遵守赫尔辛基宣言。1.可溶性CEACAM1在原发性肝细胞肝癌患者及健康人血清中的表达检测：获取健康自愿者及原发性肝癌病人外周血,制备血清。ELISA法检测血清中可溶性CEACAM1的表达。2.原发性肝细胞肝癌患者血清中可溶性CEACAMl的表达水平与临床病理参数相关性分析：采用Chi-square检验对原发性肝细胞肝癌患者血清中可溶性CEACAM1的表达水平与患者临床病理资料之间进行统计学比较,分析其相关性。3.CD34在原发性肝细胞肝癌组织中的表达检测：获取原发性肝细胞肝癌标本,制备蜡块后切片,免疫组化法检测CD34在原发性肝细胞肝癌组织中的表达。并将其代表的肿瘤微血管密度(MVD)与相应患者血清可溶性CEACAM1的表达水平做相关性分析。结果：1.与健康人相比,可溶性CEACAM1在原发性肝细胞肝癌患者血清中的表达水平明显升高(p<0.05)。2.在原发性肝细胞肝癌患者血清中,可溶性CEACAM1表达水平和患者血清HBsAg阴阳性、肿瘤大小、肿瘤数量、TNM分期、肿瘤有无血管侵犯以及肿瘤微血管密度(MVD,以CD34表示)密切相关(p<0.05)。而与患者年龄、性别、有无肝硬化表现、血清抗HCV抗体阴阳性、血清AFP水平、血清ALT水平、血清AST水平、血清GGT水平以及乙肝病毒DNA定量无明显相关性(p>0.05)。结论：1.在健康人群及原发性肝细胞肝癌患者血清中均存在可溶性CEACAM1,而可溶性CEACAM1在原发性肝癌患者血清中的水平明显增高。2.原发性肝细胞肝癌患者血清可溶性CEACAM1表达水平的增高促进了肿瘤的进展、增强了肿瘤的侵袭性,而这些可能与可溶性CEACAM1促进肿瘤微血管生成有关。第三部分可溶性CEACAM1在成血管中的作用及其机制研究目的：研究可溶性CEACAM1在体外血管生成中的作用及其机制。研究方法：1.肝癌细胞株HepG2.2.15细胞(转染了2段完整肝炎病毒的HepG2肝癌细胞)和HepG2细胞(无肝炎病毒转染的肝癌细胞)无菌上清制备：5×105个细胞接种于100ml培养瓶,细胞达到60%-80%融合后更新培养液,继续培养48小时,收取上清,每瓶4ml,分装冻于-80℃保存。2.肝癌细胞株HepG2.2.15和HepG2细胞CEACAM1表达的检测：Real-timePCR检测HepG2.2.15和HepG2细胞基因水平CEACAM1的表达。ELISA法检测培养上清中可溶性CEACAM1的表达水平。3.肝癌细胞株HepG2.2.15和HepG2细胞上清体外成血管作用检测：Matrigel胶(80ul/孔)铺于96孔板底,37℃孵育30分钟。人脐血管内皮细胞(HUVECs)悬液加到Matrigel胶上(10000个细胞/孔),根据HUVECs悬液中加入处理因素的不同分为HepG2细胞上清组、HepG2.2.15细胞上清组、HepG2细胞上清+rhCEACAM1组和HepG2.2.15细胞上清组-CEACAM1组。孵箱中培养6-8小时,显微镜下观察成血管情况。4.人重组CEACAM1蛋白体外成血管作用检测：在成血管生成实验体系中,HUVECs悬液中加入不同浓度的人重组CEACAM1蛋白同时设对照组,继续培养6-8小时,显微镜下观察成血管情况。5.肝癌细胞株HepG2.2.15和HepG2细胞VEGF表达的检测：Real-time PCR检测HepG2.2.15和HepG2细胞基因水平VEGF表达。ELISA法检测培养上清中VEGF表达水平。6. CEACAM1成管的信号通路检测：在成血管生成实验体系中,按照分组分别加入信号通路P13K抑制剂LY294002和Wortmamin、MEK抑制剂U-0126.JAK3抑制剂ZM39923和NF-κB抑制剂PDTC,作用1小时后加入人重组CEACAM1(50ng/ml),孵箱中培养6-8小时,显微镜下观察成血管情况。研究结果：1.HepG2.2.15细胞株在基因及蛋白水平的CEACAM1表达都明显高于HepG2细胞株。2. HepG2.2.15细胞株上清成管作用明显强于HepG2细胞株上清。3. HepG2.2.15细胞株及HepG2细胞株基因和蛋白水平的VEGF表达无明显差异。4.人重组CEACAM1对HUVECs细胞有明显的促进成血管作用,并且具有浓度依赖的特点。5.P13K抑制剂对重组CEACAM1成血管作用有明显抑制作用,而JAK3抑制剂、MEK抑制剂、NF-kB抑制剂则对重组CEACAM1成血管作用无明显抑制作用。结论：1.肝癌细胞基因和蛋白水平的CEACAM1表达和乙肝病毒感染有关。2.可溶性CEACAM1有明显的成血管作用,而这种作用和VEGF无明显相关性。3.可溶性CEACAM1可能通过P13K细胞通路促进肿瘤微血管生成。