论文部分内容阅读
1型鸭甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus type 1,DHAV-1）是鸭病毒性肝炎的重要病原,主要感染三周龄以内的雏鸭,发病雏鸭的死亡率高达100%。国内外对于该病的防治措施主要是对雏鸭进行弱毒疫苗的接种和高免卵黄抗体的注射,仍缺乏有效的抗病毒药物。3C蛋白是小RNA病毒保守的蛋白之一,参与病毒多聚蛋白的加工以及宿主蛋白的水解,在病毒的复制、翻译、免疫逃逸和释放过程中发挥着重要作用。然而,目前关于DHAV-1 3C蛋白的功能尚无相关报道,因此本论文对3C蛋白的水解酶活性、细胞内定位及其对宿主细胞蛋白翻译的影响进行研究,具体内容和结果如下:1 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白的水解酶活性研究根据DHAV-1 X毒株（JQ316452.1）序列设计引物扩增3C基因,构建原核表达载体及其相应表达菌。将纯化的3C蛋白与荧光多肽底物Dabcyl-ASFMNQSKVRRFE-Edans进行体外酶切实验,结果显示DHAV-1 3C蛋白能够识别和水解病毒多聚蛋白中P2区和P3区之间的氨基酸序列FMNQ-S,具有蛋白水解酶活性;该蛋白最适反应温度为37℃,最适反应p H为7.0,最适Na Cl浓度为150 m M;根据酶促反应动力学的米氏方程,测得Km值和Vmax值分别为50.78μM和16.52 nmol/min。利用优化后3C蛋白的反应条件,检测到芦平曲韦（AG7088）对DHAV-1 3C蛋白水解酶活性有抑制作用。2 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白水解酶活性关键位点的研究对DHAV-1的3C蛋白进行生物信息学分析表明,其具有由144位半胱氨酸、38位组氨酸和69位天冬氨酸组成的典型催化三分子结构和保守的Gx CG基序。进一步构建3C基因的重组真核表达载体并转染鸭胚成纤维细胞和293T细胞,以原核表达的3C蛋白制备的多克隆抗体进行Western blot检测,结果显示转染3C基因的细胞中检测到正确表达的融合蛋白以及单独存在的EGFP蛋白和3C蛋白;而将3C蛋白的38位组氨酸或144位半胱氨酸突变为丙氨酸后,只能检测到融合蛋白的条带,确定DHAV-1 3C蛋白的38位组氨酸和144位半胱氨酸为其水解酶活性的关键位点。3 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白的定位以及对宿主细胞蛋白翻译的抑制以3C蛋白多克隆抗体对DHAV-1感染和3C基因重组真核质粒转染的鸭胚成纤维细胞进行间接免疫荧光检测,结果显示在DHAV-1感染和3C基因重组真核质粒转染的鸭胚成纤维细胞中,3C蛋白在细胞质和细胞核内均有分布;而将水解酶活性位点38位组氨酸或144位半胱氨酸突变为丙氨酸后,3C蛋白会在细胞质中积聚,表明其水解酶活性能影响入核能力。Puromycin标记法检测结果显示DHAV-1感染鸭胚成纤维细胞后可抑制细胞内蛋白质的合成,但3C蛋白抑制剂AG7088能阻断病毒对宿主蛋白翻译的抑制作用,表明3C蛋白参与病毒抑制细胞的蛋白翻译过程。为进一步研究3C蛋白抑制宿主翻译的具体机制,在293T细胞中转染3C基因真核表达载体,Western blot检测与翻译相关的宿主蛋白表达情况,结果显示e IF4G、e IF5B、PTB、hn RNP K和hn RNP M的蛋白表达水平无明显变化,但PABP蛋白含量显著降低,表明PABP蛋白可能是3C蛋白抑制宿主翻译的靶点。4 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白对PABP蛋白的水解收集DHAV-1感染不同时间点的鸭胚成纤维细胞总蛋白,Western blot检测PABP蛋白的表达情况,结果显示在感染后1～6 h,PABP蛋白含量逐渐减少;而在6～12 h蛋白含量逐渐增加。使用未感染病毒的鸭胚成纤维细胞总蛋白和原核表达的鸭PABP蛋白分别进行体外酶切实验,结果显示,3C蛋白可以水解PABP蛋白产生两个大小在37 k Da～40 k Da的裂解产物,表明3C蛋白对PABP蛋白的水解不需要其他病毒蛋白或宿主蛋白的协助。构建p ET32a-Flag-PABPWT-HA、p ET32a-Flag-PABPQ341A-HA、p ET32a-Flag-PABPQ367N-HA和p ET32a-Flag-PABPG368N-HA重组载体,原核表达鸭PABP蛋白和PABP突变蛋白进行体外酶切实验,结果显示3C蛋白可水解PABPWT、PABPQ341A和PABPG368N蛋白,而不能水解PABPQ367N蛋白,鉴定出3C蛋白能特异性水解PABP蛋白的WTAQ367-G368氨基酸序列。DHAV-1分别感染si RNA敲低PABP和过表达PABP蛋白的鸭胚成纤维细胞,q RT-PCR检测病毒拷贝数,结果显示PABP的敲低降低了病毒拷贝数;而PABP的过表达显著提升了病毒拷贝数。进一步的研究发现,在表达PABPQ367N突变蛋白的细胞中DHAV-1拷贝数低于表达PABPWT蛋白的细胞,但均显著高于空载对照组;单独表达N端PABP1-367截短蛋白时,病毒的拷贝数没有变化;表达C端PABP368-557截短蛋白可降低病毒拷贝数。这些结果表明,PABP蛋白能促进DHAV-1的复制,其被3C蛋白水解后产生的N端产物不再具有促进病毒复制的作用,而C端产物可抑制病毒的复制。5 1型鸭甲型肝炎病毒3C蛋白参与病毒诱导细胞凋亡分别收集DHAV-1感染后72 h和96 h的鸭胚成纤维细胞以及转染3C基因真核表达载体60 h的鸭胚成纤维细胞,抽提DNA ladder并进行电泳,结果显示DHAV-1的感染和3C蛋白的表达均能使鸭胚成纤维细胞的基因组发生断裂,表明DHAV-1和3C蛋白均可诱导细胞发生凋亡。在DHAV-1感染的鸭胚成纤维细胞中,q RT-PCR检测了在不同感染时间点凋亡相关因子的转录水平,结果显示凋亡因子caspase-3、caspase-8、caspase-9在感染48 h开始显著上调,Cyt-c在60 h出现显著上调,均在72 h达到峰值,其中,caspase-8和Cyt-c m RNA上调水平显著高于其他凋亡因子。这些结果表明DHAV-1感染60～72 h,细胞凋亡开始发生。Western blot检测结果显示在DHAV-1感染鸭胚成纤维细胞12～84 h,细胞的RIPK1蛋白含量减少;3C基因真核表达质粒的转染致使鸭胚成纤维细胞中RIPK1蛋白含量降低,但体外酶切实验证明3C蛋白不能直接切割RIPK1,表明RIPK1蛋白的减少不是由于3C蛋白的直接水解,可能是3C蛋白抑制宿主细胞的翻译所致。综上,DHAV-1感染细胞过程中能够编码具有蛋白水解酶活性的3C蛋白;3C蛋白的38位组氨酸和144位半胱氨酸是其水解酶活性位点;且3C蛋白能识别P1位为谷氨酰胺,P1’位为丝氨酸、甘氨酸或天冬酰胺,P4位为疏水性氨基酸如苯丙氨酸或色氨酸的底物。依赖于水解酶活性,3C蛋白在病毒感染和单独表达过程中能进入细胞核;能特异性水解真核翻译起始必需的PABP蛋白,水解位点是PABP蛋白的Q367-G368,从而参与DHAV-1抑制鸭胚成纤维细胞的蛋白翻译过程。此外,3C蛋白也是DHAV-1感染晚期诱导细胞发生凋亡的重要因素。