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研究背景及目的视网膜母细胞瘤是最常见的儿童眼内恶性肿瘤。目前的治疗方式有直接摘除眼球及剜出眼眶内容物、化学减容法、激光光凝、温热疗法、冷冻疗法、外照放疗等。基因治疗尚处于研究阶段。微泡造影剂作为一种新型的基因转移载体,在声像图的监控下进行超声辐照,微泡能够在指定部位“爆破”,释放所携带的基因。本文通过体外实验研究超声微泡造影剂携带野生型p53(wtp53)基因对视网膜母细胞瘤细胞进行转染的效率及探讨wtp53基因对视网膜母细胞瘤细胞的作用效果。第一部分超声波对Y79细胞生长活性的影响方法将培养的Y79细胞分为6组,其中3组分别予以超声条件为0.5、0.75、1.0W/cm2,作用时间均为60s的连续波辐照,另外3组分别予以超声条件为0.5、0.75、1.0W/cm2,作用时间均为30s的连续波辐照。用0.4%台盼蓝直接染色4 min,显微镜观察,计数被染色(死)细胞和拒染(活)细胞。结果台盼蓝染色结果显示:当超声强度为1.0W/cm2,辐照时间不论是60s还是30s,细胞存活率均<50%;当超声强度为0.5、0.75W/cm2,辐照时间60s时,细胞存活率均<70%;当超声强度为0.5、0.75W/cm2,辐照时间30s时,细胞存活率均﹥90%。结论在0.5-0.75W/cm2,30s范围内的超声,对Y79细胞的生存无影响,0.5W/cm2条件下Y79细胞的存活率更高,与0.75W/cm2的差异具有统计学意义。第二部分超声微泡介导野生型p53基因转染Y79细胞与传统转染方法效率的比较方法第二部分在第一部分实验的基础上,以0.5W/cm2声强,辐照时间30s的连续波,对Y79细胞进行wtp53基因的转染,并同传统的脂质体转染法进行了转染效率的对比。Y79细胞分为三组,以不同的转染方法进行wtp53基因的转染。①质粒+微泡+超声照射转染;②质粒+脂质体转染;③质粒+超声照射转染。培养24-48h后,用RT-PCR定量检测mRNA表达。结果RT-PCR显示第①组(质粒+微泡+超声照射组)和第②组(质粒+脂质体组)可见较亮的电泳条带,第①组的wtp53/β-actin光密度比值较第②组大,二者的差异具有统计学意义,第③组(质粒+超声照射组)未检测到目的基因表达。结论浓度适当的微泡在优化的声强条件下,可获得wtp53基因对Y79细胞较高的转染效率,超声微泡作为一种新型的转染介质,可达到高效的基因转染目的。第三部分野生型p53基因转染后对Y79细胞生长活性的影响方法把Y79细胞分为四组,以不同的转染方法进行wtp53基因的转染,①质粒+微泡+超声照射转染;②质粒+脂质体转染;③质粒+超声照射转染;④空白对照组(即不施加任何处理)。培养培养24-48h后,用流式细胞仪检测Y79细胞的凋亡情况。结果流式细胞仪检测显示第①组(质粒+微泡+超声照射组)细胞凋亡率达25.58%,第②组(质粒+脂质体组)细胞凋亡率达19.50%,第③组(质粒+超声照射组)和第④组(空白对照组)细胞凋亡率均低于10%。结论wtp53基因对RB瘤细胞具有较明显的抑制生长的作用;质粒+微泡+超声辐照,质粒+脂质体转染,以及质粒+超声辐照,均可促进Y79细胞的凋亡,但超声微泡介导的转染引起的凋亡率高于脂质体转染,而二者的凋亡率又明显高于质粒+超声转染。