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目的:
为研究7型腺病毒温州株(Ad7wz1)基因组主要序列及重组7型腺病毒(Ad7)载体的构建,分离得到Adwz1病毒株,克隆Ad7wz1基因组ITR(invcrtcd terminalrepeats)、E1A261R、E1855kDa、Hexon和E3等主要序列并测序分析,构建Ad7感染性克隆,为进一步构建重组Ad7载体及应用于新型疫苗研究提供方法基础。
方法:
1、Ad的分离培养和基因组DNA提取、酶切鉴定以A549细胞分离培养痰液标本中的腺病毒。病毒纯化后提取基因组DNA进行BamHI、HindⅢ和SmaⅠ的酶切分析。
2、Ad7wz1基因组主要序列的克隆以提取的Ad7wz1基因组DNA为模板,PCR扩增Ad7wz1 ITR-L、E1A261R、E1855kDa、Hexon、E3和ITR-R完整的基因,并将其克隆入pMDTM18-T Simple Vector中分别构建成重组质粒pMD18Ts-ITR-L,pMD18Ts-E1A261R,pMD18Ts-E1855kDa,pMD18Ts-Hexon,pMD18Ts-E3和pMD18Ts-ITR-R。通过限制性内切酶酶切和测序鉴定质粒构建是否正确。
3、Ad7wz1基因组主要序列BLAST比对分析将测序后的六段基因序列于NCBI数据库进行BLAST比对。通过与GenBank已发表的各基因组进行相似度比较以确定该病毒株是否为Ad7。
4、Ad7wz1基因组主要序列同源性分析经酶切鉴定正确后将各重组子送大连宝生物测序并与已在GenBank发表的五个Ad7基因组序列进行BLAST比对,并用BioEdit软件对Ad7wz1 ITR-L、E1A261R、E1855kDa、Hexon、E3、ITR-R区的核苷酸及氨基酸序列进行同源性分析。
5、穿梭载体pMD18Ts-Adl-Adr的构建通过引入BamHI和EcoRI位点而改造了pMDTM18-T Simple Vector。利用PCR的方法,以提取的Ad7wz1基因为模板,扩增Ad7wz1左右两端同源臂Adl和Adr完整的基因,并将其克隆入已改造的pMDTM18-T Simple Vector构建成穿梭载体pMD18Ts-Adl-Adr。通过限制性内切酶酶切和测序鉴定质粒构建是否正确。
6、Ad7感染性克隆pMD18Ts-Ad7的构建及感染性鉴定穿梭载体pMD18Ts-Adl-Adr经Pmel线性化后与Ad7wz1 DNA共转化于感受态E.coli BJ5183中,氨卞霉素抗性平板筛选较小单菌落,挑取菌落培养并抽提质粒。限制性内切酶鉴定质粒构建是否正确。将构建好的感染性克隆pMD18Ts-Ad7转染至A549细胞,观察是否病变以鉴定是否具有感染性。
结果:
1、Ad的分离培养和基因组DNA提取、酶切鉴定病毒基因组DNA的BamHI、HinndⅢ和SmaⅠ酶切图谱,对照国外文献,从BamHI的带型初步确定本次分离的Ad病毒株为Ad7d2型。
2、Ad7wz1基因组主要序列T克隆的构建各重组质粒双酶切及ITR-L、E1A261R、E1855kDa、Hexon、E3、ITR-R基因测序结果表明重组质粒pMD18Ts-ITR-L、pMD18Ts-E1A261R、pMD18Ts-E1855kDa、pMD18Ts-Hexon、pMD18Ts-E3和pMD18Ts-ITR-R构建成功。
3、Ad7wz1基因组主要序列BLAST比对分析 BLAST比对结果显示本文得到的病毒基因组与HAd7有着最高的相似度,表明该病毒株为7型腺病毒。
4、Ad7wz1基因组主要序列同源性分析序列分析及Bioedit软件比对结果表明其核苷酸序列和相应的氨基酸序列与GenBank已经发表的Ad7全基因组序列(AY495969、AY601634、AY594256、AY594255、BK005235)比较同源性分别达到93.0％～100.0％和98.0％～100.0％。
5、穿梭载体pMD18Ts-Adl-Adr的构建 pMD18Ts-Adl-Adr酶切及Adl和Adr基因测序结果表明pMD18Ts-Adl-Adr穿梭载体构建成功。
6、Ad7感染性克隆pMDT18s-Ad7的构建及感染性鉴定 pMD18Ts-Ad7酶切、转染A549细胞产生CPE的结果表明Ad7感染性克隆pMD18Ts-Ad7构建成功并具有稳定感染性。
结论:
本实验成功分离和鉴定了Adwz1病毒株,对Ad7wz1基因组主要序列进行了分析,并成功构建了Ad7感染性克隆pMD18Ts-Ad7,为重组7型腺病毒载体的构建打下基础,并为进一步探讨Ad7感染性克隆在基因治疗及疫苗研究方面提供方法。