miR--10a--5p对非小细胞肺癌发生发展的影响及β--羟基异戊酰紫草素干预机制的研究

来源 :扬州大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:saya1989
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本课题通过体内外实验,研究miR-10a-5p与非小细胞肺癌发生发展的关系,以及β-HIVS抗肺癌的分子作用机制,为寻找高灵敏性和特异性的肺癌诊断标志物及临床肺癌分子靶向治疗提供新的靶点和理论依据。  第一章 miR-10a-5p在非小细胞肺癌患者组织和血清中的表达及临床意义  目的:  检测非小细胞肺癌患者组织和血清中miR-10a-5p表达,探讨其与临床病理特征的关系。  方法:  (1)收集NSCLC患者血清标本80份,健康志愿者血清75份。肺癌患者手术切除新鲜癌组织和癌旁组织20对。  (2)通过qRT-PCR法检测组织和血清中miR-10a-5p的表达水平。  (3)分析NSCLC患者组织和血清中miR-10a-5p表达水平与临床病理特征之间的关系。  (4)以受试者工作特征曲线评价miRNA-10a-5p用于诊断非小细胞肺癌的价值。  结果:  (1)NSCLC患者癌组织中miRNA-10a-5p表达水平明显高于癌旁组织,NSCLC患者组血清miR-10a-5p表达高于健康对照组。  (2)miR-10a-5p表达水平与肿瘤分期和淋巴结转移呈正相关。  (3)血清miR-10a-5p诊断NSCLC的曲线下面积(AUC)为0.709,其灵敏度和特异度分别为65.98%和72.71%。与癌胚抗原(CEA)的联合诊断可提高诊断价值,AUC为0.801,敏感性为76.34%;特异性为79.26%。  结论:  miR-10a-5p与非小细胞肺癌的发生发展密切相关,有望成为非小细胞肺癌早期诊断的生物标志物。  第二章 miR-10a-5p对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响  目的:  探讨miR-10a-5p对非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭和迁移等生物学行为的影响。  方法:  (1)以正常肺上皮细胞BEAS-2B为对照,通过qRT-PCR技术检测肺癌细胞株A549、H1650和H1299中miR-10a-5p的表达水平;选取miR-10a-5p高水平表达的细胞株作为后续实验的研究对象。  (2)慢病毒感染A549细胞,下调细胞株中miR-10a-5p的表达水平。  (3)采用CCK8法、流式细胞术、Transwell小室法检测miR-10a-5p对肺癌A549细胞的增殖、侵袭、迁移以及细胞周期的影响。  (4)建立A549细胞裸鼠移植瘤模型,检测miR-10a-5p对肿瘤生长的影响,检测肿瘤体积、质量等,绘制肿瘤生长曲线,并计算抑瘤率。  结果:  (1)肺癌细胞株A549中miR-10a-5p具有较高的表达水平。  (2)慢病毒感染后,A549细胞中miR-10a-5p的表达水平明显降低(P<0.05)。  (3)体外实验显示,下调miR-10a-5p的表达能够抑制A549细胞的增殖、诱导细胞凋亡、阻滞细胞G1期向S期的发展、抑制细胞侵袭和迁移。  (4)体内实验显示,下调miR-10a-5p的表达能够显著抑制肺癌裸鼠移植瘤的生长。  结论:  体内外实验结果表明,miR-10a-5p作为癌基因,下调其表达水平可显著抑制A549肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。  第三章 miR-10a-5p在非小细胞肺癌中的靶基因及其作用机制  目的:  研究miR-10a-5p在NSCLC中的靶基因、分子通路及其作用机制。  方法:  (1)利用生物信息学方法预测miR-10a-5p的靶基因。  (2)采用双荧光素酶报告基因法验证miR-10a-5p对所预测靶基因是否具有直接靶向调控作用。  (3)采用免疫组化法检测NSCLC患者癌组织、癌旁组织以及裸鼠移植瘤中靶基因的表达情况。  (4)Western blot和qRT-PCR技术检测miR-10a-5p对靶基因及其下游基因的蛋白和mRNA的表达影响。  结果:  (1)生物学信息提示,miR-10a-5p在多种生物中与GATA6的3UTR区存在保守性结合位点。  (2)双荧光素酶报告基因实验表明,miR-10a-5p可直接靶向调控转录因子GATA6基因。  (3)免疫组化实验结果显示,肺癌组织中GATA6表达低于癌旁组织,下调miR-10a-5p组裸鼠移植瘤中的GATA6表达明显高于空白对照组和阴性对照组。  (4)下调A549细胞miR-10a-5p表达后,细胞中GATA6蛋白和mRNA的表达水平升高,EGFR、CTNNB1蛋白和mRNA的表达水平降低。  结论:  miR-10a-5p对非小细胞肺癌作用机制可能与靶向调控GATA6基因,进而激活EGFR和Wnt信号通路相关  第四章 β-羟基异戊酰紫草素对A549肺癌细胞的生长抑制作用及其分子机制  目的:  研究β-羟基异戊酰紫草素(β-HIVS)对人肺癌A549细胞生物学功能的影响,并对其机制进行初步探讨。  方法:  (1)体外实验:  ①以不同浓度的β-HIVS处理A549肺癌细胞。  ②采用CCK-8法、流式细胞术、Transwell小室法检测β-HIVS对细胞增殖、周期、凋亡及侵袭和迁移的影响。  ③qRT-PCR技术和Western blot法检测β-HIVS对A549细胞中miR-10a-5p表达影响,及GATA6、EGFR、CTNNB1、P53、Bcl-2的mRNA和蛋白表达的影响。  (2)体内实验:  ①建立人肺癌裸鼠移植瘤模型,随机分为对照组,β-HIVS低、中、高剂量(10、20、40mg/kg)组和紫杉醇(30mg/kg)组;  ②各组予以腹腔注射给药,每次0.2mL,每周2次,连续用药4周;  ③检测裸鼠肿瘤体积、瘤质量等,绘制肿瘤生长曲线,并计算抑瘤率。TUNEL法检测β-HIVS处理后各组移植瘤组织中细胞凋亡情况;  ④免疫组化法、Western blot和qRT-PCR技术检测β-HIVS对移植瘤组织中miR-10a-5p、GATA6、EGFR、CTNNB1、P53、Bcl-2蛋白和mRNA的表达的影响。  结果:  (1)体外实验  ①β-HIVS能够抑制A549肺癌细胞的增殖、侵袭、迁移,阻滞细胞G1期向S期发展。  ②β-HIVS上调p53蛋白和mRNA表达,下调Bcl-2蛋白和mRNA表达,且具有呈浓度依赖性。  ③β-HIVS作用A549细胞前后,miR-10a-5p和GATA6表达没有明显改变(P>0.05)。  (2)体内实验  ①β-HIVS能够呈剂量依赖性抑制肺癌裸鼠移植瘤生长,能明显缩小肿瘤体积。  ②TUNEL法显示,与对照组相比β-HIVS处理后肿瘤细胞凋亡明显增多。  ③免疫组化、Western blot和qRT-PCR结果显示,β-HIVS处理后移植瘤组织中p53蛋白及mRNA表达升高,而Bcl-2蛋白及mRNA表达降低。  结论:  β-羟基异戊酰紫草素能抑制非小细胞肺癌生长,作用机制可能与通过调节p53和Bcl-2表达,进而诱导细胞凋亡相关。研究结果对开发适宜中药制剂或有效成份实施肺癌分子靶向治疗提供了重要的实验依据。
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