猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白nsp8多克隆抗体的制备和nsp8与nsp9蛋白的互作分析

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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是危害全球养猪产业的病毒性疾病。其病原体猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是正链RNA病毒,基因组含有9个开放阅读框(ORFs)。其中ORF1a和ORF1b可编码多蛋白pp1a和pp1ab,pp1a和pp1ab通过蛋白酶的加工可产生至少14个非结构蛋白(nsps)。通过查阅对非结构蛋白研究相关文献中发现,人们对nsp8蛋白的结构和功能的研究非常少,本文对nsp8蛋白进行了初步研究。首先我们利用网络数据库对nsp8蛋白序列进行分析,搜索和nsp8蛋白结构和功能相关的数据。然后我们构建了nsp8原核表达系统,获得了nsp8蛋白,利用纯化的蛋白免疫家兔,制备nsp8多克隆抗体,并检测了抗体的抗原结合特异性和效价。最后通过酵母双杂筛选,我们发现nsp8蛋白与nsp9蛋白可能存在互作,为了验证nsp8与nsp9蛋白间的互作关系,我们利用双分子荧光互补和Pull-down技术对nsp8蛋白与nsp9蛋白互作进行了进一步分析。通过本论文的研究,我们制备了nsp8蛋白的多克隆抗体,发现制备的抗血清具有明显的nsp8结合能力,但Western blot等结果显示血清中也存在一些非特异性的抗体。在nsp8与nsp9蛋白的互作分析中,酵母双杂和BiFC试验结果表明nsp8蛋白和nsp9蛋白存在相互作用。同时,本研究中我们发现细菌细胞表达的nsp8蛋白不稳定,极容易被降解。利用真核表达系统能否表达稳定的nsp8,以及nsp8和nsp9蛋白互作对病毒复制的影响等问题,还有待进一步研究。
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