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目的1.通过细胞实验研究,探讨应用第二代热休克蛋白90 (Heat Shock Protein 90, HSP90)抑制剂Ganetespib不同浓度作用于肝癌HepG2,对细胞增殖的影响及诱导细胞凋亡的作用,并验证不同温度对HSP90表达水平的影响。2.分析微波消融联合Ganetespib台疗对裸鼠肝癌皮下移植瘤消融后坏死范围的调控作用,并比较两者共同作用后,消融区周边HSP90及caspase-3表达水平的差异,以及对Ganetespib应用的生物安全性进行评价。3.分析微波消融联合Ganetespib治疗对消融治疗后裸鼠的肿瘤体积倍增时间及终点生存时间的差异。方法1.用CCK8比色法检测不同浓度的Ganetespib抑制肝癌HepG2细胞生长的效果;药物作用后HepG2细胞凋亡率的变化应用Annexin V-FITC/PI双染法检测；用酶联免疫吸附剂实验(enzymelinkedimmunosorbentassay, ELISA)检测不同温度作用后HSP90表达水平的变化。2.给予裸鼠最高药物耐受剂量(150mg/kg),5h后取出动物内脏进行病理检查,并同时送检无药物处理的裸鼠动物内脏,对比药物的生物安全性。建立肝癌HepG2细胞裸鼠皮下移植瘤模型。将40只裸鼠随机分配到如下4个处理组中：(1)单独微波消融组;(2)单独静脉注射Ganetespib组;(3)微波消融前2h静脉注射Ganetespib组;(4)无处理阴性对照组。分别于治疗后24h将动物脱颈处死,剥离出肿瘤,经2%2,3,5-三苯基氯化四氮唑溶液染色后观察肿瘤坏死范围,免疫组化检查HSP90及caspase-3的表达。3.建立肝癌HepG2细胞裸鼠皮下移植瘤模型。待肿瘤直径达到1.0-1.2cm时,将20只裸鼠随机分配到如下4个处理组中：(1)单独微波消融组;(2)单独静脉注射Ganetespib组;(3)微波消融前2h静脉注射Ganetespib组：(4)无处理阴性对照组。治疗后每隔2-3天观察肿瘤大小,肿瘤直径长到2.5cm或生存期达到40天设为生存终点,使用Kaplan-Meier生存分析方法比较各处理组达到研究终点的时间差异。结果1. CCK8实验结果显示Ganetespib呈时间-剂量依赖性抑制肝癌HepG2细胞增殖。Annexin-FITC/PI双染法检测结果显示,Ganetespib药物作用于细胞48h后,细胞凋亡率随药物浓度升高而增大,浓度设定为30、100、250、500及1000nmol/l,30nmol/L Ganetespib干预48h后细胞晚期凋亡率为(16.3±1.22)%(与阴性对照组比较,P<0.05),1000nmol/l Ganetespib干预48h后细胞晚期凋亡率为(56.6±1.83)%(与其他浓度组比较,P<0.05)。ELISA法检测结果显示,45℃组的HSP90浓度最高,50℃组次之,60℃组最低。 (45℃组与其他各组比较,P<0.05)2.应用Ganetespib后没有影响肝脏、脾脏、肾脏及肺的大体形态及微观病理表现。单独静脉注射Ganetespib组给药后24h没有观察到明显的坏死区域。单独微波消融组凝固坏死范围7.5±0.3mm。微波消融联合静脉注射Ganetespib组观察到较大的凝固范围9.4±0.5mm(P<0.05,与单独微波组比较)。治疗后24h,与单独微波消融组比较,联合应用Ganetespib组可以在消融区周边观察到更加微弱的Hsp90表达带(表达带厚度0.19±0.07mm,染色细胞21.4±11.2% vs.0.25±0.13mm,30.3±10.7%,P<0.05)。消融联合Ganetespib组显示出更多caspase-3的表达。(表达带厚度0.37±0.12mm,染色细胞数37.3±15.1% vs.0.25±0.18mm,27.6±11.9%,P<0.05)。3.无处理组的平均终点生存时间(从开始治疗的到肿瘤直径达25mm)为19.1±2.0天。单独应用微波消融组的平均终点生存时间比单独静脉注射Ganetespib组长,前者平均时间为26.3±2.2天,后者平均时间为23.2±2.0天(与对照组比较P<0.05)。微波消融联合静脉注射Ganetespib组表现出明显延长的生存时间,平均为33.2±1.9天(与其他组比较P<0.05)。方差分析结果显示,微波消融联合药物治疗组肿瘤体积倍增时间(25.1±1.8天)明显长于单独微波消融组(17.5±1.6天)及单独药物处理组(15.4±2.3天)(P<0.05)。结论1.第二代HSP90抑制剂Ganetespib能够抑制肝癌HepG2细胞增殖,随着药物浓度的增加,作用时间的延长,细胞活性逐渐下降,并能够促进肝癌HepG2细胞的凋亡。2. Ganetespib对裸鼠应用的生物安全性好。应用Ganetespib联合热消融治疗,可以抑制热休克蛋白的表达,增加微波消融后肿瘤的坏死范围,促进消融区周边亚致死温度带上肿瘤细胞的凋亡。3.联合应用微波消融及Ganetespib能够降低消融后亚致死温度带肿瘤生长速率,延长动物终点生存时间。