研究背景恶性黑色素瘤（Malignant melanoma，MM）简称恶黑，是全世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，它起源于人类神经嵴黑色素细胞，并由黑色素细胞恶性转化而来，它具有高度侵袭、高度转移的特性。人类恶性黑色素瘤的发病率和死亡率在持续增长，因而日益受到人们的重视，且常规化疗方法效果不佳，严重威胁着人类健康。其发病率在近20年成倍增长。据不完全统计，人类恶性黑色素瘤的发病率占人类整体恶性肿瘤的3%，而人类皮肤恶性黑色素瘤的发病率占人类全部皮肤恶性肿瘤的7%～20%，并且其发病率每年仍以4%～6%速度增长。人类皮肤恶性黑色素瘤是整形外科常见的体表肿瘤，它源于表皮正常黑色素细胞或正常痣细胞的一种恶性肿瘤，其恶性程度较高，进展极为迅速，预后极差。人类皮肤恶性黑色素瘤的发病率和死亡率在过去30年内每年递增2%～3%，现在己引起人们高度重视。到目前为止，对人类恶性黑色素瘤的治疗方法主要包括手术治疗、放射治疗、化学治疗、生物治疗以及肿瘤疫苗治疗。目前，手术治疗仍是最常用于人类恶性肿瘤治疗的手段，特别是对许多早期局部发生的人类恶性黑色素瘤，手术治疗有着良好的治疗效果。在发生了弥漫性泛转移或对重要器官浸润生长的恶性黑色素瘤，手术治疗效果较差甚至无法进行手术治疗。治疗手段主要是放疗和化疗，不过治疗的效果并不容乐观，主要是因其对常规放射治疗及化学治疗并不敏感，所以治疗效果不肯定，同时放疗及化疗对正常组织也会有杀伤作用，这些副作用以及肿瘤耐药性的产生等因素均会对化学治疗的应用产生较大的限制。生物学治疗方面目前研究较多的主要有白介素、干扰素以及粒巨噬细胞集落刺激因子等，不过目前尚无统一的用法可遵循。总而言之，应用现有的治疗手段治疗人类恶性黑色素瘤还没有十分令人满意的方法。这些年来，随着分子生物学以及免疫学、生物化学突飞猛进的发展，人们逐渐对恶性肿瘤的生物学行为有了更进一步的认识。越来越多的人认识到恶性肿瘤其实是一种基因相关性疾病，恶性肿瘤的细胞和人类正常组织的细胞既有同源性和相似性，又有异质性。恶性肿瘤细胞主要通过免疫逃逸机制逃避机体的免疫清除，但是同时恶性肿瘤组织却可产生与正常组织细胞不相同的免疫反应过程。我们所说的肿瘤疫苗正是利用了肿瘤细胞的这一特点，对恶性肿瘤细胞进行杀伤和清除，对正常组织细胞影响甚微。有一部分肿瘤疫苗已经应用于三期临床研究，并已经取得了令人振奋的进展。单核趋化因子蛋白1（monocyte chemoattractant protein1，MCP-1）又名CC趋化因子配体2（chemokine C-C motif ligand2，CCL2），属于趋化因子CC家族成员之一。MCP-1是CC趋化因子家族之中最早被发现的，且研究得最多的成员之一。该因子可由多种细胞分泌产生，例如白细胞、成骨细胞、单核细胞、平滑肌细胞、纤维原细胞、星形细胞、内皮细胞以及一些肿瘤细胞等。MCP-1具有诸多功能，例如趋化调节单核细胞、NK细胞、记忆性T细胞及中性粒细胞等往炎症部位迁移、浸润的功能。另外有研究显示，MCP-1可通过与CC类趋化因子受体（CCR2）结合从而发挥多种生理作用，例如诱导淋巴细胞以及NK细胞等细胞的活化、分化和发育等，同时还可参与血管的再生过程，这有利于肿瘤的生长或抑制功能，另外该因子还可增加巨噬细胞浸润及巨噬细胞介导的血管再生。这些年来，MCP-1的研究越来越多，尤其是其在细胞凋亡中的作用机制已经成为该类研究的焦点。MCP-1属于β类趋化因子，同样具有一般CC家族趋化因子的结构特征，另外其N端的氨基酸残基形成螺旋结构，这是MCP-1一级结构中的关键部位，这在其识别受体及转导信号中具有重要的作用。近年来的研究重点除了应用单纯的自体或异体肿瘤细胞疫苗进行治疗，同时对肿瘤细胞进行基因修饰，或加用免疫佐剂以增加肿瘤细胞的免疫原性。因此，本课题拟以MCP-1基因为研究对象，将该基因转录入野生型恶性黑色素瘤细胞株构建基因修饰肿瘤疫苗，从免疫治疗和基因治疗两方面共同探讨恶性黑色素瘤治疗方法，为人类恶性黑色素瘤的免疫治疗提供一条新的途径。研究目的构建MCP-1的真核表达载体，并转染小鼠黑色素瘤细胞株B16从而构建含有趋化因子MCP-1的小鼠恶性黑色素瘤疫苗，研究该疫苗在体外对淋巴细胞趋化作用；选用裸鼠作为实验动物，使用同型小鼠胸腺T移植重建裸鼠部分免疫功能，通过构建该类裸鼠恶性黑色素瘤动物模型并研究该疫苗在体内是否具有抗肿瘤活性，并初步探讨及其发生机制。研究方法1.目的基因MCP-1的获取提取小鼠肝脏总RNA，反转录成cDNA，根据GeneBank登录的小鼠MCP-1cDNA序列（序列号为AF065929），利用Primer5设计软件设计小鼠MCP-1引物。并对目的基因进行PCR扩增。于1﹪琼脂糖凝胶电泳1小时，UV灯下观察扩增片段。对目的片段进行回收纯化。2.构建重组质粒pEGFP-N1-MCP-1制备感受态大肠杆菌，将目的基因转化入载体质粒pEGFP-N1，碱裂解法提取重组质粒pEGFP-N1-MCP-1，并进行酶切鉴定。3.重组质粒pEGFP-N1-MCP-1转染裸鼠恶性黑色素瘤细胞株B16参照LipofectamineTM2000试剂盒使用说明书进行转染，实验分为三组：实验组、空载体对照组和空白对照组，每组做3个重复孔。实验组用4μL重组质粒pEGFP-N1-MCP-1，空载体组加入等量的空质粒pEGFP-N1，空白对照组加入等量的无菌PBS溶液。4.转染效果测定转染后48h对三组细胞进行荧光显微镜观察，通过观察转染后绿色荧光蛋白的表达情况，从而判定转染效果。5.筛选稳定表达MCP-1的细胞株B16-MCP-1将小鼠黑色素瘤细胞株B16进行G418筛选浓度的选择，取转染48h后的B16细胞，加初始筛选终浓度的G418进行筛选，直至出现抗性克隆，对抗性克隆进行扩大培养，进行细胞的传代及冻存以备后续试验使用。6.重组细胞的鉴定及细胞增殖检测将筛选出来的抗性克隆进行扩大培养3周后，分别取各组细胞提取总RNA，进行RT-PCR，测定MCP-1转录情况，对重组细胞进行鉴定。用ELISA方法检测重组细胞中MCP-1蛋白的表达情况。并将筛选出的稳定表达MCP-1的B16细胞及对照组细胞细胞用MTT法增殖实验，用酶标检测仪测定490nm波长出的OD值。7.小鼠黑色素瘤B16MCP-1趋化型肿瘤细胞疫苗B16-MCP-1体外功能检测首先用多步骤离心法收集趋化型肿瘤细胞疫苗B16-MCP-1中趋化因子MCP-1，选取健康裸鼠，颈椎脱臼法处死裸鼠取其脾脏，密度梯度离心法收集裸鼠脾脏单个核细胞。用Transwell小室侵袭实验对趋化型肿瘤细胞疫苗B16-MCP-1对单个核细胞体外趋化活性的测定。倒置显微镜下随机计数5个高倍镜视野下迁移至微孔膜背面的淋巴细胞数。按下式计算趋化指数:趋化指数=实验组移行的细胞数/对照组移行的细胞数。8. BABL/c型小鼠T细胞的分离颈椎脱臼法处死小鼠，无菌条件下取出小鼠的胸腺，在灭菌载玻片上研磨在研磨的过程中滴加不含血清的培养基，后经300目金属网过滤，收集细胞悬液，使用密度梯度离心法分离单个核细胞，无菌PBS洗涤2次，将细胞接种于完全培养基，在37℃、5%CO2培养2h后，吸出未贴壁的细胞用尼龙毛柱分离小鼠T淋巴细胞。9.裸鼠部分免疫功能重建及预防性接种将筛选出的适于实验的裸鼠45只随机进行分三组，每组15只：第一组为生理盐水空白对照组（Nacl组），第二组为空载体pEGFP-N1转染细胞对照组（野生型B16疫苗组），第三组为趋化型肿瘤疫苗B16-MCP-1治疗组（趋化型B16-MCP-1疫苗组）。裸鼠部分免疫系统功能重建：将分离出的小鼠胸腺T细胞经腹腔注射的方法注射到筛选出的裸鼠体内，3×107/只（0.5ml），以恢复裸鼠部分免疫系统的功能。预防性接种：采用左侧腹股沟皮下，单点注射对裸鼠进行免疫接种，Nacl组注射0.2mL Nacl，空载体细胞组注射空载体pEGFP-N1转染细胞0.2mL（含细胞2×104），B16-MCP-1细胞组注射趋化型肿瘤疫苗B16-MCP-10.2mL（含细胞2×104）。免疫接种每周一次，共3次。10.裸鼠黑色素瘤动物模型的建立的观察第3次免疫接种后1周，在裸鼠右肩背单点注射野生型小鼠黑色素瘤细胞B160.2mL（也就是2×104/mL/只）建立裸鼠黑色素瘤模型。观察模型裸鼠的一般情况，成瘤后观察移植瘤的生长情况，每隔2～3天记录一次裸鼠的体重，游标卡尺测肿瘤长径及短径（长径a值短径b值）记录肿瘤大小，共观察11周。按照下述公式计算小鼠肿瘤体积，肿瘤体积=长×宽2×0.52。裸鼠发生死亡终止进行肿瘤体积大小的测量，进行生存期的观察。11.肿瘤细胞疫苗B16-MCP-1对裸鼠脾淋巴细胞CTL杀伤活性的影响以上各组实验小鼠每组取5只裸鼠，于第3次免疫接种后1周，用颈椎脱臼法处死裸鼠，解剖裸鼠腹腔取其脾脏，采用密度梯度离心法制备裸鼠脾脏淋巴细胞最为效应细胞，小鼠黑色素瘤细胞B16作为靶细胞，按照效应细胞:靶细胞为25:1将各组裸鼠脾脏淋巴细胞及小鼠黑色素瘤细胞B16加入96孔细胞培养板中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。48h后弃去上清200L，加入MTT溶液15L/孔，继续培养4h后弃上清，以DMSO溶解MTT，用酶标检测仪于波长570nm测定OD值，计算杀伤率。淋巴细胞的杀伤率（%）=（1-（效应细胞OD值+靶细胞OD值-实验组OD值)/靶细胞OD值）×100%。研究结果1.小鼠MCP-1基因的RT-PCR结果以小鼠肝脏组织提取的总RNA为模板，经反转录及PCR扩增后，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，可以观察到特异性扩增带，条带大小相当于480bp，与预期的大小完全一致。2.重组质粒pEGFP-N1-MCP-1的酶切鉴定结果将回收的MCP-1的PCR产物与载体pEGFP-N1进行连接，然后将连接产物转化感受态大肠杆菌，将挑选出的阳性克隆进行质粒的提取，经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后行1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示在4.7kb处和480bp处各有一条亮带，与质粒载体及目的基因大小相符，证明所构建的真核表达质粒pEGFP-N1-MCP-1大小及方向正确。空质粒组只在4.7kb处有一条亮带。3.重组细胞的鉴定小鼠黑色素瘤细胞株B16经脂质体转染并经G418筛选后，对抗性克隆进行扩大培养约3周左右收获各组细胞进行RT-PCR并进行行1%琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结果显示：实验组出现在大约480bp处出现一条明显条带，与阳性对照组条带相对应，而转染空质粒组无目的条带的出现。ELISA结果显示：实验组可见MCP-1的表达，而对照组未见有阳性结果出现。4. Transwell小室侵袭实验对趋化型肿瘤细胞疫苗B16-MCP-1对单个核细胞体外趋化活性的测定结果趋化型肿瘤细胞疫苗B16-MCP-1组细胞侵袭数目明显高于空白培养基阴性对照组及野生型B16疫苗组，而野生型B16疫苗组趋化的单个核细胞数目与阴性对照组相似，表明趋化型疫苗B16-MCP-1能够表达并分泌具有趋化功能的MCP-1趋化因子。5.免疫接种后各组黑色素瘤小鼠模型的大体观察动物模型建立后第4d开始部分裸鼠有可触及的肿瘤生成，30d后，第一组和第二组裸鼠全部有肉眼可见的肿瘤，30d成瘤率100%。第三组裸鼠至第30d开始成瘤，成瘤率为20%，至第50d成瘤率为60%。有4只裸鼠在观察时间内未见肿瘤形成。第30d开始第一组开始有2只裸鼠肿瘤发生破溃，实验全程该组总共有5只裸鼠发生肿瘤的溃破。第35d开始第二组有1只裸鼠肿瘤发生破溃，实验全程共2只裸鼠肿瘤发生破溃。第三组第60d有1只裸鼠肿瘤发生破溃，但溃破程度较轻，本组中其余荷瘤裸鼠在实验过程中未见肿瘤破溃。第一组和第二组裸鼠出现明显消瘦，裸鼠目光呆滞，活动减弱等恶液质现象，第三组裸鼠生存状态明显好于前两组裸鼠。6.肿瘤生长情况观察动物模型建立2周内各组裸鼠肿瘤体积大小无明显差异（P>0.05），2周以后至整个观察时间点内，第三组裸鼠肿瘤体积明显小于第一组（P﹤0.05），19d开始至整个观察时间点内三组裸鼠两两之间的体积比较均有明显差异（P﹤0.05）。7.小鼠生存时间观察动物模型建立后第7天开始第一组裸鼠开始出现死亡，第二组裸鼠10开始出现死亡，至第55d，第一组及第二组裸鼠全部出现死亡。第三组裸鼠至35d开始出现裸鼠死亡，至观察结束（80d）仍有4只裸鼠存活。第三组与第一组及第二组相比，生存时间明显延长（P<0.01），第一组与第二组相比裸鼠生存时间基本一致（P>0.05）第三组与第一组及第二组相比，生存时间明显延长（P<0.01），第一组与第二组相比裸鼠生存时间基本一致（P>0.05）。8.肿瘤细胞疫苗B16-MCP-1对小鼠脾淋巴细胞CTL杀伤活性的影响与第一组及第二组相比，第三组淋巴细胞出现了明显的特异性杀伤肿瘤细胞的活性，两者之间的差异具有统计学意义（P<0.01），而第一组和第二组则无明显特异性杀伤作用，两者相比差异不大（P>0.05）。这表明转染MCP-1提高了裸鼠对恶性黑色素瘤细胞的特异性杀伤作用，提高了裸鼠的抗肿瘤特性。结论1.成功构建MCP-1真核表达载体pEGFP-N1-MCP-1。2.成功构建小鼠趋化型肿瘤疫苗B16-MCP-1，该疫苗在体外具有趋化小鼠单个核细胞的功能。3.该趋化型疫苗对裸鼠恶性黑色素瘤具有明显的免疫效果，能减轻荷瘤裸鼠的症状，延长裸鼠的生存期。