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利用整株转基因方法进行基因功能分析,尤其是对于难以转化的作物,如豆科作物,不仅费时,费力且成本高。然而这种瓶颈在研究与根系生物学相关基因的功能时可以被克服,例如利用发根农杆菌介导的转化,产生具有转基因的根部和非转基因地上部的复合植株,来研究植物共生,病原菌侵染,营养吸收及激素转运中起作用的基因的功能,是一条省时、省力且成本低的有效途径。在本研究中,分别应用以潮霉素,除草剂和卡那霉素作为筛选剂的载体pCambia 1305.2,pCambia3301和pCambia 2301,建立并优化了大豆毛状根转化系统,并应用此系统在菜豆上研究磷高效转运基因PvPTl的功能。本研究为根系生物学研究有关基因的功能分析提供了理论基础。本研究结果如下:
1.建立并优化了大豆发根农杆菌介导的下胚轴转化系统,供试材料为大豆粤春04-5,粤春03-3和巴西10号的幼苗,将供试大豆置于湿度≥80%的培养箱中,罩上聚乙烯袋以保持湿度,农杆菌接种5-7天后,下胚轴侵染部位长出毛状根,但转化效率很低(约30-55%)。为了提高转化效率,本研究分别利用以潮霉素,除草剂和卡那霉素作为筛选剂的载体pCambia 1305.2,pCambia 3301和pCambia2301,并用筛选剂浸润的岩棉包裹农杆菌侵染部位以保持湿度,结果表明应用浓度为50mg/L潮霉素,135mg/L除草剂,100mg/L卡那霉素大大提高了三种不同转化载体的转化效率,转化效率分别为:粤春04-5 80%,粤春03-3和巴西10号70%。本研究迸一步研究了光照和温度对于转化效率的影响,结果表明,与24小时全光照相比,16小时光照8小时黑暗提高了转化效率。温度也影响转化效率,与24小时恒定25oC相比,28oC光照和25oC黑暗条件下转化效率有所降低。因此,温度25oC,16小时光照8小时黑暗条件下,针对含有不同筛选标记基因的载体,应用筛选剂浓度50mg/L潮霉素(pCambia 1305.2),135mg/L除草剂(pCambia3301)或100mg/L卡那霉素(pCambia 2301)可以大大提高转化效率。
2.从cDNA文库中克隆高亲和力磷转运子PvPT1,并应用洋葱表皮进行亚细胞定位分析,结果表明此转运子定位于质膜上,与生物信息学预测结果相符合。此外,在菜豆复合植株中进行PvPT1过量表达与干涉分析,结果表明过量表达PvPTl提高了复合植株的磷吸收,磷含量和生物量均高于干涉及对照植株;而干涉植株无论是低磷还是高磷的情况下均抑制了磷的吸收,且减少了体内磷含量和生物量。
综上所述,本研究建立和优化了发根农杆菌介导的大豆毛状根转化系统,为与根系生物学有关基因的功能分析提供了更为简便高效的手段;此外,本研究成功研究了PvPTl基因在菜豆复合植株中的功能,结果表明,过量表达PvPTl,无论在高磷还是低磷条件下,均可提高复合植株磷的吸收和生物量。研究结果对于在酸性土壤上培育磷高效转基因作物具有重要的指导意义。