碱性蛋白酶(EC 3.4.21)具有很多重要特殊的性质,如耐高温、碱性试剂、表面活性剂以及有机试剂等,因此被广泛的用作洗涤添加剂、食品增味剂、皮革的脱毛和软化等。商品化的微生物蛋白酶制剂与碱性蛋白酶相比,其性质存在显著的不稳定性。另外,目前工业化应用的蛋白酶产品绝大多数来源于芽孢杆菌属,放线菌来源的碱性蛋白酶极少并且被人们所忽视。因此,从放线菌资源中筛选产碱性蛋白酶菌株,对于丰富蛋白酶资源以及扩大工业化的实际应用具有很重要的意义。本实验从采集的土样中进行分离产碱性蛋白酶放线菌菌株,通过菌落在含有酪蛋白的高氏培养基上产生的透明圈的大小进行初筛,再通过对酶活测定进行复筛,最后得到一株产较高活性碱性蛋白酶的菌株,其在初始培养基中的蛋白酶活性达到138 U/mL。通过16S rDNA序列进行分析得出,该菌株为Streptomycessp.,被命名为Streptomyces sp.M30。为了能够使Streptomycessp.M30达到最大产酶量,对发酵培养基中碳源含量及培养条件进行优化。优化后的高氏培养基成分为:8 g/L可溶性淀粉,1.7 g/LKCl,0.5 g/L KN03,0.5 g/L Na2HP04·12H20,0.5 g/L MgS04,0.02 g/L CaC03,0.01 g/L FeS04;培养条件为:初始pH7.0,接种量10%,培养温度20℃,优化后酶活为313 U/mL,是优化前的2.3倍,酶活提高了 127%。发酵培养后,对发酵液上清中粗酶酶学性质进行了的研究。粗酶液的最适反应温度为80℃,在0-50℃温度范围内酶活没有影响,在60 ℃保温2.5 h,残留酶活在85%以上。最适pH为9.0,在pH4.0-9.0范围内均保持良好的稳定性。不同的金属离子对酶活性几乎没有影响。根据该碱性蛋白酶的性质,该碱性蛋白酶被命名为SapH。碱性蛋白酶SapH纯化步骤为:硫酸按沉淀(0-100%),疏水柱层析,阴离子交换柱层析。纯化后该碱性蛋白酶的比活力为29071.8 U/mg,纯化倍数为4.7倍,酶活力回收率为3.6%,通过质谱分析得出蛋白分子量为54.7 kDa,该碱性蛋白酶SapH的Km和Vmax分别为35.71 mg/mL,5 × 104U/mg。通过对纯酶的酶学性质进行研究表明,SapH的最适反应温度为80 ℃,在70-85℃均具有很高的活性,在0-40℃温度范围内具有很好的稳定性,在50 ℃保温2 h,酶活性保留65%以上,60℃保温30 min,残留酶活力在40%以上。SapH的最适反应pH为9.0,在pH4.0-10.0范围内能保持很好的稳定性,在pH6.0-10.0其酶活均能保持在90%以上。PMSF能完全抑制酶的活性,表明SapH为丝氨酸蛋白酶家族。Cu2+,Mn2+,Ni2+均能提高酶的活性,相对酶活分别达到147%,113%,112%;EDTA,EGTA,DTT对酶活性具有很强的抑制作用。另外,该酶在DMF,DMSO,methanol,acetone等溶剂中均保持很高的活性,非金属离子表面活性剂Tween 80能使酶活性提高至121%。根据肽指纹图谱结果克隆出碱性蛋白酶SapH核苷酸编码序列sapH,该基因全长1,179bp,编码392个氨基酸。与来源于Streptomyces sp.AA0539的假设蛋白同源性为100%。通过构建表达载体,使其在大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统、毕赤酵母表达系统中进行异源表达。结果显示,表达载体均能成功转入宿主菌株,但未检测到蛋白酶活性。