【摘 要】
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目的:在观察正常和短暂性前脑缺血大鼠海马N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体2A亚单位mRNA及蛋白质表达变化规律的基础上,选用针对NMDA受体NR2A亚单位的反义寡核苷酸,在形态学角
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目的:在观察正常和短暂性前脑缺血大鼠海马N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体2A亚单位mRNA及蛋白质表达变化规律的基础上,选用针对NMDA受体NR2A亚单位的反义寡核苷酸,在形态学角度观察阻断CA1区NR2A表达后在缺血性脑损伤中产生的变化,从而揭示NR2A亚单位在缺血性脑损伤中的作用,为研制和开发针对2A亚单位的特异性新药提供一定的理论基础和形态学依据.方法:该研究采用四血管阻断方法制作大鼠前脑缺血(15分钟)再灌注模型,再灌时间分别为24h和48h.实验动物采用S-D雄性大鼠,体重250-300g,实验动物共分三组:正常组(n=24),假手术组(n=48),缺血再灌组(n=48).每组大鼠分别给予右侧海马CA1区注射生理盐水(NS),只插针不注射生理盐水(INSERT),正义寡核苷酸(SNR2A)和反义寡核苷酸(ANR2A)4种处理方式.用4﹪多聚甲醛(加入1/1000 DEPC)在缺血组复灌后的24和48小时、正常组和假手术组的对应时间灌注固定大鼠.固定后的鼠脑在经过后固定、脱水、透明、浸蜡和包埋等步骤后,用石蜡切片机在针道前后进行切片.切片分成8套(焦油紫染色1套、TUNEL染色1套、原位杂交染色2套、免疫组化2套、阴性对照2套);以45℃的水温展片;每张载片贴2张脑片,注意方位和清洁;凉干后,70℃下烤片3h,收存以备后续实验.焦油紫染色的切片直接在显微镜下进行观察,比较各种处理情况下正常组和缺血组海马CA1区锥体细胞的构筑及病理改变.免疫组织化学和原位杂交的切片除了显微镜下的直接观察外,还采用LEICA Qwin图像处理和分析系统通过灰度测量的方法对海马CA1区针道周围的锥体细胞的反应强度进行定量检测,以半定量分析2A亚单位mRNA和蛋白质的表达水平.TUNEL染色采用光镜下阳性细胞计数法,定量分析凋亡细胞的数量.结论:该研究应用反义技术,通过免疫组化和原位杂交在前脑缺血模型中证明了所选用2A亚单位反义寡核苷酸的有效性,而目前为止,这一现象尚未见文献报道.并发现前脑缺血早期,2A亚单位的mRNA和蛋白并不呈现一致变化,目前尚未有对两者同时进行分析的报道.对此现象的最有利的解释是脑缺血并未改变转录水平,但抑制了翻译过程.通过在体局部给药(NR2A反义寡核苷酸),在TUNEL染色上显著降低了凋亡细胞的数量,已有实验表明NR2A的特异性的反义寡核苷酸对NR1和NR2B的mRNA水平无影响.这一结果表明2A亚单位在神经细胞的凋亡中起重要作用,NR2A亚单位发挥功能的具体作用机制有待于进一步实验所证实.
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