背景和目的：　　 先天性肛门直肠畸形（ARM）是小儿常见的消化道畸形，发病率为1/5000-1/1500，其病理改便及发病机制极为复杂，至今尚未完全阐明。课题组前期研究显示先天性肛门直肠畸形除肛门直肠解剖结构异常外，肛周肌肉也存在明显发育不良，同时支配盆底肌的脊髓运动神经元和运动神经末梢均存在明显发育异常，提示这些改变可能是导致肛门直肠畸形术后排便功能障碍（便秘、便失禁等）的主要原因之一。　　 在生理状态下，排便受多种因素控制，其中来自腰骶段脊髓感觉核（背根节）可接受盆底肌肉的神经传入冲动。当粪便下降到低位直肠便可刺激肛周肌肉的牵张感受器经骶神经传至脊髓腰骶段感觉核（背根节）再传入脊髓后联合核(DCN)在此整合后将信号传至大脑，从而引起肛周肌肉的收缩舒张变化，协调控制正常排便过程。在排便控制的整个环节中，感觉神经元的功能是否正常对于排便控制具有极其重要的作用。但目前的研究绝大多数集中在肌肉和运动神经元方面，关于支配肛周肌肉的感觉神经元方面研究报道较少。因此，本研究将建立先天性肛门直肠畸形的动物模型，利用胎仔外科、显微外科和显微注射相结合技术进行荧光金神经逆向示踪，对肛门直肠畸形胎鼠支配肛提肌腰骶髓感觉神经元的形态、分布和数量进行研究，判定先天肛门直肠畸形是否存在感觉神经元发育异常。同时利用宫内干细胞移植的方法，观察移植干细胞分化为感觉神经元和神经营养因子表达的情况，探索先天性肛门直肠畸形治疗新方法。另外利用神经电生理和肛门直肠测压的方法对先天性肛门直肠畸形患儿的直肠和肛周皮肤感觉功能进行检测，从动物模型到临床进行多角度探讨先天性肛门直肠畸形的感觉神经元变化规律和治疗新方法。　　 材料与方法：　　 1、先天性肛门直肠畸形动物模型制作:将Wistar大鼠雌雄（比例4∶1）交配后，清晨阴道涂片发现精子者定为孕0天，在孕10天时，60只孕鼠为ETU致畸组，经胃管注入1％ETU，剂量为125mg/kg，制作肛门直肠畸形动物模型。　　 2、荧光金示踪方法:大鼠怀孕20天，进行胎儿外科手术，在体视显微镜下解剖会阴部，分离肛提肌（由球海绵体肌发出一束肌肉呈U字形向后包绕直肠），将与显微注射器相连的玻璃针(直径50μm)吸取5％荧光金(Fluorogold，FG)，分别注射肛提肌两侧，每次剂量为0.5μl，注射后暂留针1分钟，减少FG外流，会阴部创面生理盐水冲洗。　　 3、宫内移植骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法:用贴壁培养法进行大鼠MSC原代培养并传代，携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的腺病毒转染第3代骨髓MSC。将转染的MSC注射到先天性肛门直肠畸形胎鼠腰骶髓中，母鼠妊娠20d时取先天性肛门直肠畸形胎鼠脊椎，固定脱水后连续冰冻横切片，免疫荧光方法检测脊髓中EGFP阳性MSC表达巢蛋白(Nestin)和感觉神经元标志物BRN-3的情况。　　 4、神经电生理和肛门直肠测压的方法:本研究利用会阴-肛门反射弧时间测定方法，对45例不同类型先天性无肛畸形患儿的肛门外括约肌神经电生理方面的异常进行探讨。采用美国Cadwell sierra Console肌电和神经诱发电位检测仪，由Cadwell双极表面刺激电极产生刺激信号，由双极表面不锈钢肛探电极记录肛门外括约肌肌电信号，观察记录肛门外括约肌的肌电活动，并对会阴-肛门反射潜伏期及肛周皮肤感觉阈值进行定量分析。同时应用直肠肛管测压方检测直肠感觉阈值、感觉-收缩时间，观察对照组和畸形组直肠感觉的变化。　　 结果：　　 1、先天肛门直肠畸形胎鼠支配肛提肌感觉神经元分布情况:正常胎鼠标记的感觉神经元位于腰骶段背根节部位，主要分布腰5至骶1脊髓节段，神经元体积较大而且圆，分布均匀。先天性肛门直肠畸形胎鼠标记的感觉神经元分布节段与正常胎鼠类似，但神经元体积明显减小。　　 2、先天肛门直肠畸形胎鼠支配肛提肌感觉神经元数量:根据畸形情况共分为五组:正常组（15胎鼠）、给药无畸形组（14只胎鼠）、低位肛门直肠畸形组（18只胎鼠）、高位肛门直肠畸形组(41只胎鼠)和高位肛门直肠畸形合并脊柱裂组（13只胎鼠），感觉神经元数量分别是11804±2362个、10429±708个、2886±705个、1026±425个和964±445个。低位肛门直肠畸形组、高位肛门直肠畸形组和高位肛门直肠畸形合并脊柱裂组的标记感觉神经元数量均明显减少，与正常对照组和给药无畸形组相比均出现统计学差异，P＜0.05。正常组和给药无畸形组相比，感觉神经元数量变化无统计学意义。　　 3、先天性肛门直肠畸形胎鼠移植MSC的分化和神经生长因子表达情况:对40例胎鼠进行宫内MSCs移植，移植MSCs可在胎鼠脊髓组织中分化为BRN-3阳性的感觉神经元。移植MSCs可促进EGF、FGF8、FGF2、FGF20神经生长因子的表达，对于神经细胞的营养和生长均起到一定作用。　　 4、先天性肛门直肠畸形患儿神经电生理检测和直肠肛管测压结果:会阴-肛门反射潜伏期和肛周皮肤感觉阈值，除了低位畸形未合并便失禁组以外的先天性肛门直肠畸形患儿组均明显高于正常儿组，而且合并便失禁组要明显高于无便失禁组，出现统计学差异，P＜0.05。直肠感觉阈值和感觉-收缩时间，除了低位畸形未合并便失禁组以外的畸形患儿组均明显高于正常儿组，出现统计学差异，P＜0.05。虽然合并便失禁组要高于无便失禁组，但只有直肠感觉阈值在低位畸形合并便失禁组与未合并便失禁组相比出现统计学差异。　　 结论：　　 1、先天性肛门直肠畸形胎鼠支配肛提肌脊髓背根节感觉神经元数目明显减少，体积缩小，呈发育不良改变，而且畸形位置越高改变越明显。　　 2、移植MSCs可在胎鼠脊髓组织中分化为BRN-3阳性的感觉神经元，而且MSCs移植可增进神经生长因子的表达，对于神经细胞生长和分化起一定作用。　　 3、先天性肛门直肠畸形患儿会阴-肛门反射潜伏期、肛周皮肤感觉阈值、直肠感觉阈值和感觉-收缩时间改变明显，提示患儿的直肠和肛周肌肉、皮肤的感觉功能存在异常。