【研究目的】乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。除手术治疗外,化疗和内分泌治疗是乳腺癌治疗的重要手段。对化疗药物产生多药耐药是导致乳腺癌化疗失败的重要因素。所谓多药耐药是指肿瘤对一种药物产生耐药的同时,对其他结构、作用机制不同的药物也产生抗药性。乳腺癌多药耐药的机制较复杂,而过表达ATP膜转运家族蛋白是重要的因素之一。由多药耐药基因1(mdr1)编码的P-糖蛋白就是该家族的一员。与其它膜转运蛋白相同,P-糖蛋白通过水解ATP产生的能量,将进入细胞内的药物泵出细胞,从而降低药物对细胞的杀伤作用,使细胞产生耐药。目前报道显示许多抗肿瘤药物包括长春新碱、多柔米星、紫杉醇等均为P-糖蛋白的作用底物。50%的乳腺癌耐药与P-糖蛋白的表达相关。因此逆转由P-糖蛋白介导的多药耐药将对乳腺癌的治疗起重要作用。为了逆转P-糖蛋白介导的肿瘤多药耐药,人们采用了许多方法,包括化学药物治疗、天然药物治疗、免疫学治疗、基因治疗等。化学合成的抑制剂可以增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。但是化学药物在达到治疗浓度时往往具有较大的毒性。选择性阻断耐药蛋白mRNA的表达是一种有效的逆转耐药的方法,本课题组曾经分别应用反义寡核苷酸以及核酶等方法逆转P-gp介导的MDR的研究,各种方法均能在不同程度上抑制P-gp的作用,但未能达到预期的结果;这可能与核酶的抑制效率较低以及反义寡核苷酸和核酶的降解效率受靶基因mRNA二级结构的影响较大,不容易筛选靶序列有关,此外耐药肿瘤细胞中存在其他的机制也可能是逆转效果不理想的原因。近期研究发现,葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)也是引起肿瘤多药耐药的因素之一。GCS催化UDP-glucose上的糖基与神经酰胺相结合,使细胞逃避神经酰胺介导的促凋亡作用。神经酰胺,是由细胞膜神经鞘磷脂水解产生的一种脂质分子,是介导细胞凋亡的第二信使,参与了肿瘤细胞对化疗和放疗的反应。研究发现,GCS糖基化产物葡萄糖神经酰胺(Glucosylceramide,GlcCer)在耐药肿瘤细胞中的表达水平明显升高,抑制神经酰胺的糖基化可以逆转对化疗药物的耐药性。许多化疗药物可以抑制GCS的活性并增加细胞内神经酰胺的合成。如PPPP(1-phenyl-2-hexadecanoylamino-3-pyrrolidino-1-proranol)、PDMP(1-phenyl-2-dsdecanoylamino-3-morpholino-1-propanol)和cyclosorin A。但在临床实验中这些药物特异性不高,且具有较强副作用,限制了其应用。RNA干扰技术是新近研究中有效的分析基因功能的工具。其高效的基因沉默功能使其一经发现就表现出强大的生命力。该技术通过导入细胞双链RNA(dsRNA)而导致序列特异性的基因沉默。dsRNA在体内可以被一种具有RNaseⅢ样活性的dsRNA特异性核酸内切酶(Dicer)作用切割成21-23bp长的小干扰RNA(siRNA)。siRNA接着与RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)结合,特异性识别和切割目的mRNA。由于RNAi具有特异性和高效性,并且和反义寡核苷酸相比,siRNA介导的基因沉默更有效,持续时间更长,因此,我们拟应用携带RNA干扰序列的重组质粒载体同时沉默乳腺癌中mdr1基因和GCS基因的表达,从而提高乳腺癌多药耐药的逆转效率。【研究方法】1.分别设计并合成针对mdr1基因和GCS基因的双链干扰RNA序列,将其定向插入到质粒载体pSUPER中,经酶切及测序鉴定。然后选用合适的酶切位点酶切,获得含有RNA干扰序列及其上游的H1启动子的片段,并将其插入到含有绿色荧光蛋白(EGFP)和稳定筛选标记的质粒载体pEGFP-C1中,构建稳定表达载体pEGFP-MDR1和pEGFP-GCS。酶切及测序鉴定正确后,大量扩增。2.应用脂质体将上述干扰质粒载体同时转染到高表达P-糖蛋白和GCS的乳腺癌细胞系MCF-7/ADM中,并设空白对照组及仅转染一种干扰质粒组。培养48h后,通过RT-PCR检测各组细胞中mdr1 mRNA和GCS mRNA的表达情况,应用western blot检测P-糖蛋白和GCS蛋白表达情况,应用罗丹明外排实验检测P-糖蛋白外排功能,应用MTT法检测各组细胞对阿霉素、长春新碱的半数细胞抑制浓度(IC50)的改变。3.各组细胞转染不同载体后,继续培养48h,加用G418对其进行筛选。约2周后得到稳定表达干扰RNA序列的细胞系。继续培养3周后,通过RT-PCR检测各组细胞中mdr1 mRNA和GCS mRNA的表达情况,应用western blot检测P-糖蛋白和GCS蛋白表达情况,应用罗丹明外排实验检测P-糖蛋白外排功能,应用MTT法检测细胞耐药指数的改变。从而对RNA干扰的长期逆转效率进行评价。【实验结果】1.转染48h后,应用半定量RT-PCR检测各组细胞中mdr1 mRNA和GCS mRNA的表达情况,结果显示:与MCF-7/ADM相比(我们假定MCF-7/ADM组的相对mRNA水平为100%),M0组(转染质粒pEGFP-MDR1)、G0组(转染质粒pEGFP-GCS)、GM0组(共转染质粒pEGFP-MDR1和pEGFP-GCS)的mdr1 mRNA的表达水平分别降为1.105±0.99%、38.75±9.7%和0.4491±0.22%,而GCS mRNA的表达水平分别降为7.464±3.0%、38.34±16%and 3.142±0.64%,显著低于MCF-7/ADM组及对照组(P＜0.01)。进一步分析发现,GM0细胞的MDR1 mRNA和GCS mRNA表达水平也低于单独干扰组。Western blot检测结果表明GM0组细胞两种蛋白水平明显减低,且显著低于M0和G0组。罗丹明外排实验显示:耐药细胞的荧光强度为2.727%±0.4834,G0、M0细胞荧光强度分别为33.71%±2.267和17.25%±1.024,而GM0组细胞荧光强度为50.12±6.349。RNA干扰组细胞与MCF-7/ADM组相比,差异具有统计学意义(P＜0.01)。而GM0组与G0、M0组相比,P-gp功能显著降低。MTT法检测细胞对化疗药物的耐受性,发现G0、M0、GM0组细胞对阿霉素和长春新碱耐药性明显降低,GM0组明显低于G0和M0组。此外分析结果可以发现,抑制mdr1基因的表达会引起GCS基因表达的降低,而下调GCS基因也会导致mdr1基因表达下调。2.筛选出稳定表达细胞系后,培养3周,应用半定量RT-PCR检测各组细胞中mdr1 mRNA和GCS mRNA的表达情况,结果显示:M1组(转染质粒pEGFP-MDR1)、G1组(转染质粒pEGFP-GCS)、GM1组(共转染质粒pEGFP-MDR1和pEGFP-GCS)mdr1 mRNA的表达水平分别降为MCF-7/ADM组的46.04±3.8%、13.39±0.69%和0.6715±0.71%,而GCS mRNA的表达水平分别降为64.11±2.7%、25.28±5.9%and 4.321±2.7%,显著低于MCF-7/ADM组(P＜0.01)。且GM1细胞的MDR1和GCS mRNA表达水平也低于单独干扰组。而与瞬时转染组相比,mRNA水平无明显差异。Western blot检测结果表明GM1细胞两种蛋白水平明显减低,且显著低于M1和G1组。罗丹明外排实验显示:G1、M1、GM1细胞荧光强度均较MCF-7/ADM细胞内荧光强度显著增强,而GM1组荧光强度明显高于G1和M1组。三组细胞与瞬时转染组相比无明显差异。MTT法检测细胞对化疗药物的耐受性,发现G1、M1、GM1组细胞对阿霉素和长春新碱耐药性明显降低,与瞬时转染组相比差异不大。【结论】1.RNA干扰可以通过抑制靶基因mRNA的表达,从而显著降低蛋白的产生。2.瞬时转染结果表明抑制mdr1基因或GCS基因可以有效逆转乳腺癌多药耐药,而同时抑制mdr1基因和GCS基因比单独抑制更有效。3.稳定转染后检测结果显示携带RNA干扰片度的质粒可以较长时间抑制靶基因的表达(至少3周)。4.实验结果表明,mdr1基因表达下调可以引起GCS基因的表达部分抑制,反之亦然,说明乳腺癌中mdr1基因与GCS基因可以相互影响,发挥协调作用。