研究背景:青光眼是一组威胁和损害视神经视觉功能，以视神经萎缩和视野缺损为共同特征的一种疾病，是主要致盲眼病之一，其病情非常凶险，危害性极大，发病很迅速，世界卫生组织已将其列为第二位致盲眼病[1]，通过激光、药物、手术，降低眼压是目前治疗青光眼的主要方法之一。目标是尽可能减少眼压增高和眼压波动导致的视功能的损害，然而单纯降低眼压并不能阻止青光眼导致的进行的视神经损害，视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs)和视神经的损伤也很可能由其他病理机制导致。在祖国传统医学中，青光眼属于“五风内障”范围，晚期亦可属于“青盲”、“视瞻昏渺”等范围。其基本病机是由于风火上攻头目，或气郁生火、脾湿生痰、痰火上攻造成肝郁化火、肝胆火炽、痰火上扰、阴偏盛或阳偏盛、气机瘀滞等诸种原因，导致气血失和、经脉失利，目中玄府闭阻，血瘀气滞，瘀滞神水、目系失养发为此病。病位主要在肝，涉及肾、脾。中医药治疗青光眼主要以清火、解郁、活血、利水、祛风、开窍、理气、通络，后期以滋补肝肾、疏肝解郁等法为主[2]。与现代医学认为的由于机械性损伤、缺血性损伤导致的氧化损伤等因素致使视网膜神经节细胞不断死亡及视神经轴突不断减少基本一致[3]。全球青光眼药物治疗的最新研究热点—视神经保护，即通过药物或其他方法使那些还没有受损的或者仅轻度受损的，甚至正处于毒性内环境濒临死亡的RGCs得到存活或继续延长生存时间；然而在临床上，现有的视神经保护药物的治疗效果却非常不理想，究其原因可能是药物在视网膜、视神经局部有效浓度低吸收差，导致疗效不佳。目前视神经保护药物主要通过口服、静脉注射和肌肉注射给药，均是通过全身循环后才能到达眼部组织，不但无法达到有效的治疗浓度，也增加了药物所带来的全身毒副作用。因此寻求一种让神经保护药物更为有效、局部应用于RGCs和视神经的新型给药方式，成为了临床治疗的急迫需求。直接应用于RGCs和视神经的新型给药方式将会被临床所接受。目的当今青光眼治疗还未攻克的核心难点是视网膜神经节细胞的凋亡导致视神经的损害。目前临床治疗的给药方式存在药效不显著及全身毒副作用大的缺点。随着生物技术应用的迅速发展，临床上靶向释放药物的新技术—超声微泡，即通过药物体内定位释放技术，不仅能显著降低药物用量，减轻药物的毒副作用，同时能提高病灶区域内的药物浓度，延缓药物释放、减少给药次数，用药准确从而增强治疗效果。研究已证实白蒺藜皂苷（gross saponins from Tribulus terrestris L，GSTT）与注射用鼠神经生长因子（Mouse Nerve Growth Factor for Injection,mNGF）能明显减少视网膜神经节细胞凋亡增强其存活，对治疗视神经损害起到一定的作用。本课题拟首次开发一种新型超声微泡介导的眼科局部给药系统，同时研究人参皂苷Rg1（Ginsenoside Rg1）对视网膜神经节细胞的影响。本研究通过体外细胞实验，及体内动物实验，应用安全及适宜的超声声强、辐照时间、微泡浓度，研究超声破坏微泡介导药物对视网膜神经节细胞的抗凋亡机制。该给药系统和三种药物单剂的应用，能有效提高视网膜局部的药物浓度，用量准确，减少全身毒副作用，延缓或阻止青光眼视神经损害的发生及发展，给青光眼患者带来更有效的治疗，降低其致盲率，延缓病情恶化，为患者复明带来新的希望。方法1.新生Sprague-Dawley大鼠视网膜神经节细胞（RGCs）体外原代培养与纯度鉴定。2.研究N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）对大鼠原代视网膜神经节细胞（RGCs）细胞凋亡的影响。通过四唑盐（MTT）比色法检测定细胞存活率：①测定不同浓度的NMDA（1000μM、100μM、10μM）对RGCs细胞存活率的影响，选择NMDA造模浓度。②按照步骤①选定的NMDA浓度，通过四唑盐（MTT）比色法测定细胞在30min、24h、48h三个不同时间点的存活率。3.白蒺藜皂苷、注射用鼠神经生长因子、人参皂苷Rg1三种药物对NMDA诱导的大鼠原代视网膜神经节细胞损伤的保护作用。筛选白蒺藜皂苷（10-5μg/ml、10-4μg/ml、10-3μg/ml、10-2μg/ml）、注射用鼠神经生长因子（6×10-2μg/ml、8×10-2μg/ml、10×10-2μg/ml、12×10-2μg/ml）、人参皂苷Rg1（100μg/ml、101μg/ml、102μg/ml、103μg/ml）三种药物对抗RGCs凋亡的最佳有效药物浓度。计算细胞存活率的同时确定这三种药物对RGCs保护的最佳质量浓度（实验中细胞存活率相对最高者所对应的三种药物质量浓度)。4.正常兔眼玻璃体腔注射人参皂苷Rg1的视网膜、视神经安全性研究。健康新西兰大白兔12只，随机分为4组，每组3只（6眼）。实验组分组如下：A组正常对照组玻璃体腔内注射0.9%生理盐水0.1ml；B组玻璃体腔注射低剂量（0.05mg/kg）人参皂苷Rg1，C组玻璃体腔注射中剂量（0.5mg/kg）人参皂苷Rg1，D组玻璃体腔注射高剂量（2.5mg/kg）人参皂苷Rg1。于注药后1周、2周、4周分别行行为学观察，Accupen手持式眼压计每日测量眼压，用裂隙灯显微镜,直接检眼镜,眼部B超、眼前段照相、眼底照相、OCT活体观察兔眼眼前节和眼底变化情况，4周后空气栓塞处死新西兰大白兔，取视网膜、视神经行光学显微镜和透射电镜观察视网膜、视神经组织形态和超微结构。玻璃体腔注药每隔3天用药一次，共28天,第28d处死兔子取材。5.兔眼玻璃体腔注射人参皂苷Rg1后观察经超声辐照微泡干预和未经超声辐照微泡干预，同一时间点不同眼组织内药物浓度的比较及同一眼组织中不同时间点的药物浓度比较。健康新西兰大白兔48只，实验组分组如下：左眼玻璃体腔注射(2.5mg/kg)人参皂苷Rg10.1ml，右眼玻璃体腔注射(2.5mg/kg)人参皂苷Rg10.1ml后注入(45μg/ml)声诺维0.1ml，注射完毕后闭合兔眼涂耦合剂，置超声探头于眼球上方立即用频率1MHZ，声强为0.5W/cm2照射眼球60s，每个时间点6只新西兰大白兔，于注药后30min、1h、2h、3h、4h、6h、12h、24h采用空气栓塞处死兔,分别取房水、玻璃体、视网膜脉络膜、视神经组织进行高效液相色谱法的检测。6.超声靶向击破微泡介导视神经保护药物治疗青光眼性视神经损害的实验研究。采用前房注射0.3%复方卡波姆溶液建立兔慢性高眼压视神经损害动物模型。健康新西兰大白兔24只，随机分为8组：1空白对照组（玻璃体腔内注射0.9%生理盐水0.1ml）、2高眼压模型组（不做处理）、3高眼压模型组+玻璃体腔注射人参皂苷Rg1组（玻璃体腔内注射0.1ml人参皂苷Rg1溶液）、4高眼压模型组+玻璃体腔注射mNGF组（玻璃体腔内注射0.1mlmNGF溶液）、5高眼压模型组+玻璃体腔注射人参皂苷Rg1+超声组（玻璃体腔内注射0.1ml人参皂苷Rg1溶液后给予声强为0.5W/cm2的辐照60s）、6高眼压模型组+玻璃体腔注射mNGF+超声组（玻璃体腔内注射0.1mlmNGF溶液后给予声强为0.5W/cm2的辐照60s）、7高眼压模型组+玻璃体腔注射GSTT+超声+微泡组（玻璃体腔内分别注射0.1ml人参皂苷Rg1溶液和0.1ml微泡混悬液，然后给予声强为0.5W/cm2的辐照60s）、8高眼压模型组+玻璃体腔注射mNGF+超声+微泡组（玻璃体腔内分别注射0.1mlmNGF溶液和0.1ml微泡混悬液，然后给予声强为0.5W/cm2的辐照60s）。各组处理每隔3天一次，共28天,于注药后1周、2周、4周分别行行为学观察，Accupen手持式眼压计测量眼压，用裂隙灯显微镜,眼部B超、眼前段照相，活体观察兔眼眼前节变化情况，4周后空气栓塞处死兔，取兔视网膜和视神经，行兔视网膜病理切片、光镜测量视网膜厚度、视网膜和视神经透射电镜检测、检测视网膜内NO、MDA、SOD的含量。结果1.成功建立了简便易行的新生SD大鼠视网膜神经节细胞（RGCs）体外原代培养方法。获得了较为纯化的RGCs，免疫细胞化学法显示RGCs的纯度为90%以上，该方法培养的RGCs体外存活时间可达5d。2. NMDA可诱导大鼠视网膜神经节细胞凋亡。NMDA诱导RGCs损伤后，细胞发生凋亡还是死亡，主要取决于NMDA的浓度，本实验在体外培养RGCs中加入NMDA(100μM)30min，体外模拟视神经损伤后的微环境，四唑盐（MTT）比色试验检测凋亡细胞数，证实100μM的NMDA能成功诱导RGCs发生凋亡。NMDA对于体外培养的大鼠RGCs的兴奋性毒性作用为剂量依赖性，加入10μM、100μM、1000μM NMDA30min后，RGCs的存活率分别为91.46%、64.74％、50.02%。浓度达到100μM及以上时与正常对照组RGCs的存活率比较有明显差异(P<0.05)。加入100μM NMDA分别作用30min、24h、48h的存活率分别为63.3%、55.19%、46.98%，随着时间的延长，RGCs的存活率显著下降；伴随剂量加大，时间延长，RGCs的存活率也随之下降。因此，选择100μM作用30min进行后续实验。3.人参皂苷Rg1可抑制NMDA诱导的视网膜神经节细胞凋亡，促进体外培养的RGCs的存活，保护视网膜神经元。四唑盐（MTT）比色试验显示，经NMDA处理30min的RGCs细胞存活率均有下降，加药组细胞存活率均较NMDA损伤组提高，其中10-4μg/ml GSTT+NMDA组，8×10-2μg/ml mNGF+NMDA组,102μg/ml人参皂苷Rg1+NMDA组，相对于其它剂量组均能提高细胞存活率。三种药物均能促进体外视网膜神经节细胞的存活，具有显著的视神经保护作用。4.正常对照组和不同药物剂量实验组兔眼前后节未见明显异常，玻璃体腔内未见明显炎性混浊，视网膜未见脱离等并发症。正常对照组和实验组光学显微镜观察视网膜组织形态和透射电镜观察视网膜、视神经超微结构均未见明显异常改变。通过行为学、眼前节、眼底、眼部B超及组织学结果均证实，玻璃体腔注射不同浓度的（0.05mg/kg、0.5mg/kg和2.5mg/kg）人参皂苷Rg1，对兔眼视网膜、视神经无明显毒副作用，是安全的。5.单纯玻璃体腔注药组和玻璃体腔注药后经超声辐照微泡干预组，两种不同方法兔眼玻璃体腔注射人参皂苷Rg1后24h内,除各组玻璃体中人参皂苷Rg1含量呈梯度下降,峰值时间为15min,其余眼部组织(房水、视网膜脉络膜、视神经)人参皂苷Rg1含量呈正态曲线变化。其达峰值时间为房水及眼内壁组织视网膜脉络膜先达峰值,均为3h,而眼外壁组织达峰值时间较晚,视神经为4h。将单纯玻璃体腔注药组和玻璃体腔注药后经超声辐照微泡干预组兔眼各组织人参皂苷Rg1达峰值含量进行比较,经超声辐照微泡干预组各组织人参皂苷Rg1峰值含量均明显高于单纯玻璃体腔注药组,具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，说明玻璃体腔注射药物经超声辐照微泡干预后较单纯玻璃体腔注药能够在眼内各组织达到高的药物浓度。将各组各球壁组织人参皂苷Rg1峰值含量进行比较，发现玻璃体腔注射人参皂苷Rg1眼部各组织含量分布为玻璃体＞视网膜脉络膜＞视神经＞房水。除外玻璃体内因直接注射人参皂苷Rg1导致高药物浓度，视网膜、视神经为最能获得理想药物含量的组织，因此玻璃体腔注射人参皂苷Rg1是保证眼后节疾病治疗，特别是视网膜神经保护作用药物浓度的有效方法。超声辐照微泡在此基础上进一步提高了药物利用度。6.兔眼前房注射0.3%复方卡波姆溶液是一种较好的慢性高眼压模型制作方法，成功建立了青光眼性视神经视网膜损害模型。兔视网膜光镜形态学观察：1组兔视网膜神经节细胞呈单层排列，细胞大小不一，轮廓不规则，核深染，细胞边界清晰，细胞排列整齐紧密，分层清楚；2组模型组兔视网膜神经节细胞数目明显减少，各层结构疏松，排列紊乱，层间分界不清晰，视网膜神经节细胞层呈大量空泡样改变，部分细胞严重变性，出现核溶解、核染色浅淡、胞浆染色浅淡，核结构稀疏，核仁固缩及偏位，胞质染色质边集，内质网肿胀，线粒体肿胀，嵴消失，空泡变性。3、4、5、6组兔视网膜神经节细胞数目相对减少，兔视网膜各层结构相对完整，排列轻度紊乱，分层相对清晰，可见散在空泡样变的细胞；7、8组视网膜各层结构较完整，排列较整齐，形态大致正常，内外核层出现少量细胞丢失，局部有轻度空泡样改变。光镜测量兔视网膜厚度，各组兔视网膜厚度的差异均具有统计学意义（P＜0.05）；2组兔视网膜厚度明显薄于1组，差异有统计学意义（P＜0.05）；3、4、5、6组兔视网膜厚度明显厚于2组，差异有统计学意义（P＜0.05）；7、8组兔视网膜厚度明显明显厚于3、4、5、6组，差异有统计学意义（P＜0.05）。兔视网膜超微结构观察：1组正常视网膜神经节细胞核呈类圆形，RGC细胞核膜清晰，染色均匀，核仁明显，内、外核层核染色质颜色清晰，分布均匀，内质网、线粒体等细胞器形态正常，细胞膜完整，感光细胞排列整齐。2组模型组感光细胞线粒体不同程度肿胀、空泡样变；内、外核层结构紊乱；RGC数目减少，肿胀色淡。3、4、5、6组RGC胞核内充满均匀、色浅淡的常染色质，感光细胞排列稍有紊乱，线粒体未见明显肿胀及空泡样变，内核层少数细胞染色质边集，部分核稍有变形，核染色质略显稀疏，颜色稍淡，线粒体轻度空泡变性，可见线粒体嵴，内质网仅见轻度肿胀。7、8组视网膜神经元未见明显坏死及凋亡，RGC染色质分布均匀，核仁明显，粗面内质网基本正常，线粒体改变不明显，光感受器的外节盘膜排列整齐，未见明显溶解。兔视神经超微结构观察：1组正常兔视神经纤维粗细不等,髓鞘完整，排列紧密、规则,呈“发丝”状，轴突外表光滑,包绕轴突的髓鞘板层致密,视神经髓鞘完整,轴浆均匀,轴浆内可见清晰的正常微管、微丝和椭圆形的线粒体；2组模型组神经纤维普遍发生病变,可见轴索消失,髓鞘排列紊乱,节段性松解、溶解、萎缩成团或脱髓变性,胶质增生明显，微管和神经微丝结构消失，线粒体肿胀、空泡变性；3、4、5、6组视神经髓鞘相对不规整，部分髓鞘变薄、疏松呈“洋葱皮”状，轴突内微管和微丝肿胀，但不消失，部分线粒体空泡变性；7、8组视神经髓鞘排列相对致密，髓鞘完整、规则,无脱髓鞘现象，可见微管、微丝，轴突结构接近正常。兔视网膜组织内NO、MDA、SOD含量的检测：2组兔视网膜NO、MDA的含量较1组明显升高，SOD活性较1组明显降低，比较有显著统计学差异(P＜0.05)。3、4、5、6、7、8组NO、MDA的含量较2组明显降低，SOD活性较2组明显升高，比较有显著统计学差异(P＜0.05)。结论SD大鼠RGCs体外培养成功，且RGCs较纯化，是一种较理想的细胞培养实验模型。NMDA对RGCs具有兴奋性毒性作用，可诱导RGCs凋亡；白蒺藜皂苷、注射用鼠神经生长因子及人参皂苷Rg1具有对抗NMDA诱导的RGCs凋亡，保护视网膜神经节细胞，增强其活性的作用；玻璃体腔注射2.5mg/kg的人参皂苷Rg1，对兔眼视网膜、视神经无明显毒副作用，是安全的。兔前房注射复方卡波姆溶液是一种较理想的兔高眼压造模方法。复方卡波姆诱发的兔青光眼模型具有引起眼压中度、稳定升高，持续时间长,方法简单,易于操作和控制等优点，可用于对青光眼性视神经视网膜损害的研究及对抗青光眼药物的研究,是一种较理想的兔青光眼模型。超声靶向破坏微泡能靶向释放药物，增强药物到达眼部的浓度，超声击破微泡介导视神经保护药物人参皂苷Rg1和mNGF治疗高眼压兔视网膜、视神经损害是有效的。超声微泡介导视神经保护药物通过改变视网膜内NO、MDA、SOD的表达量对高眼压兔视神经损害发挥保护作用。