低温显微镜已成为低温生物学研究中一个非常重要的技术,人们借助这一技术可以直观的观察到生物样品在冷冻和复温过程中的形态变化,以及溶液相变的过程,从而分析生物材料的相关特性和生物体的低温损伤机理以及确定最佳的降温、复温程序,并以此为依据客观的解释实验结果、修正理论模型和制定合理的治疗或保存程序。低温冷冻台和SYBR/PI双染色结合使用可以直接检测实验过程中各阶段精子膜的完整性。本文的研究内容主要是通过低温显微镜筛选孔雀鱼精子超低温冷冻条件和检测斑马鱼精子在各速率下冷冻到各温度段的膜完整性这两个方面。　　 在对孔雀鱼(Poecilia reticutata)精子的超低温冷冻研究中,主要研究孔雀鱼精子对温度的敏感性和筛选冷冻速率、解冻速率、抗冻剂的种类和浓度,并分析冷冻过程中观察到的精子弯曲温度、停止运动温度、结冰温度和解冻温度等参数与精子解冻后活力的关系。精子敏感性判断是通过低温显微镜观察没有加抗冻剂的HBSS-精子悬液从35℃到-8℃,再复温到35℃整个过程来评定精子鞭毛构型、游动行为和活力的变化。冷冻速率筛选选用5,25,45,65℃/min和1,25,100℃/min两组实验。抗冻剂的筛选包括14％甘油,10％二甲基亚砜,6％甲醇,5％二甲基乙酰胺四种不同种类抗冻剂和7％,14％,28％和50％四种浓度的甘油。复温速率筛选选用5,25,45和100℃/min。敏感性实验结果显示随着温度的降低,精子直线前进运动减慢,精子鞭毛由彗星式对称摆动在9℃左右开始发生中段弯曲,并约在-5.5℃停止摆动。在复温过程中精子在-1.9℃左右恢复鞭毛摆动,在5～6℃间中段弯曲恢复变直,直到9℃左右时可做冷冻前彗星式对称快速摆动并随着温度的升高精子可做环状弧形轨迹运动,直到温度升到25～35℃时精子恢复快速直线前进运动。实验结果发现在14％甘油的条件下,将精子在25℃/min的速率下冷冻到-80℃,然后在100℃/min的解冻速率下得到的精子活力最高,在35℃处活力最好可达到50～60％,这与我们采用程序冷冻仪常规冷冻得到的结果完全一致,同时也发现此条件下精子发生弯曲温度和停止运动温度也最低。进一步观察在14％Gly抗冻剂条件下20条不同个体的冷冻效果,发现精子发生弯曲弯度、停止运动温度与解冻后活力有极显著意义的负相关关系(r=-0.81),这为深化低温生物学理论研究和精子冷冻模型的建立提供重要的理论依据。目前还没有用低温显微镜来研究鱼类精液冷冻的报导,本研究是第一次。　　 斑马鱼精子超低温冷冻的研究主要是运用低温显微镜检测精子冷冻到各个温度段的各种冷冻速率效果和分析精子发生损伤的主要温度段。在1、25、65、100和130℃/min的速率下分别将精子冷冻到-10℃,-20℃和-30℃,检测-10℃、-20℃和冷冻到各个温度段后解冻到35℃处的精子膜完整性。另一组实验是在5、25、65、100和130℃/min的速率检测精子冷冻到-80℃后,分别检测解冻到4℃或35℃处精子的膜完整性。精子膜的完整性通过SYBR/PI双染色来检测,各组实验分别用8％DMSO和4％MEOH两种抗冻剂。在25～130℃/min速率之间冷冻到-10℃时,精子膜发生损伤率(PI％)仅为10％左右,解冻到35℃时约为15％,但是慢速率1℃/min条件下膜损伤率明显升高,在解冻后35℃处达到28％左右。冷冻到-20℃时同样是1℃/min慢速率膜损伤率显著高于其他各组速率,其他各组速率之间没有显著性差异,在35℃处的精子膜损伤率约为20％左右。当温度降到-30℃后解冻到35℃处的PI％结果显示各速率下8％DMSO实验组PI％均显著低于4％MEOH实验组。8％DMSO在25～130℃/min速率之间没有显著性差异,显著低于1℃/min,精子膜损伤率为28％左右。而4％MEOH实验组则是慢速率1℃/min精子膜损伤率最低,但PI％也高达72％,当速率达到25℃/min以上时,精子膜损伤率达到90％以上。当精子冷冻到-80℃时无论在解冻后4℃还是35℃处检测,均是5℃/min速率精子膜损伤率最低,8％DMSO实验组PI％约为48％,4％MEOH实验组为70％,当冷冻速率达到25℃/min以上时两组实验的精子膜损伤率均高达95％以上。说明8％DMSO实验组条件下斑马鱼精子冷冻到-30℃时25℃/min快速率精子膜损伤最小,在24％左右,当精子冷冻到-80℃时5℃/min慢速率下精子膜损伤率最小,在45％左右,速率高于25℃/min后精子膜几乎全部发生损伤。采用25℃/min从4℃冷冻到-30℃,再以5℃/min从-30℃冷冻到-80℃,解冻后精子膜的损伤率为28％左右。通过常规冷冻法验证两步速率发现精子解冻后活力最好可以达到53％。实验结果还显示了冷冻到最低温度处的精子PI％与冷冻前PI％和解冻后PI％均有显著性差异,说明斑马鱼精子膜在冷冻阶段和解冻阶段均发生一定的膜损伤。